結(jié)直腸癌（CRC）約占人類(lèi)所有惡性腫瘤的 10%，是全球第三大常見(jiàn)癌癥，其死亡率（9.4%）在惡性腫瘤中排名第二，僅次于肺癌。截至 2020 年，全球有超過(guò) 93.5 萬(wàn)人死于 CRC 或其并發(fā)癥。傳統(tǒng)的手術(shù)結(jié)合放化療的模式并沒(méi)有達(dá)到理想的治愈效果。在此背景下，免疫療法應(yīng)運(yùn)而生，并迅速成為包括 CRC 在內(nèi)的多種腫瘤的主要治療模式，并在少數(shù)患者中實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)期、持續(xù)的緩解，但大多數(shù)患者在暫時(shí)的免疫反應(yīng)后并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)腫瘤的長(zhǎng)期控制。

本研究選取了 10 例未經(jīng)治療的 CRC 患者的腫瘤、副腫瘤和血液樣本。根據(jù) SingleR 軟件包和 CellMarker 數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋?zhuān)髡咦罱K確定了 8 種主要細(xì)胞類(lèi)型，包括 CD4+ T 細(xì)胞、CD8+ T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、先天性淋巴細(xì)胞（ILCs）、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞（圖 1A）。提取每種細(xì)胞類(lèi)型并進(jìn)一步分組注釋?zhuān)罱K確定了 25 種細(xì)胞亞型（圖 1B）。根據(jù)主要細(xì)胞類(lèi)型的差異確定的前五個(gè)標(biāo)記物以氣泡圖的形式顯示出來(lái)（圖 1E）。有趣的是，當(dāng)作者追蹤組織起源時(shí)，發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞，尤其是 Tex、TAMs、樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）和成纖維細(xì)胞在腫瘤組織中高度富集（圖 1C）。為了研究 TME 中的相互作用網(wǎng)絡(luò)，作者使用 CellChat 計(jì)算了潛在的配體-受體對(duì)。為使相互作用可視化，作者進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)可視化（圖 1D）。值得注意的是，Tex、巨噬細(xì)胞、TAMs 和 DCs 與其他細(xì)胞系的細(xì)胞之間的相互作用對(duì)數(shù)最多，揭示了它們?cè)?TME 中的主導(dǎo)作用。

圖1 來(lái)自 CRC 患者腫瘤、鄰近腫瘤組織和外周血的單細(xì)胞概況

1. CD8+ T cells

CD8+ T細(xì)胞被分為九個(gè)亞群，并被注釋為四種細(xì)胞類(lèi)型：幼稚CD8+ T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD8+ T細(xì)胞（Tem）、效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞（Teff）和Tex（圖2A）。為了明確每種細(xì)胞類(lèi)型的功能，作者提取了標(biāo)記基因，并將其載入 Metascape （圖 2B, C ）。偽時(shí)間軌跡顯示，CD8+ T 細(xì)胞變得衰竭（圖 2D），抑制受體（IRS）的表達(dá)以階梯方式增加。作者通過(guò)單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷和聚類(lèi)（SCENIC）分析對(duì) CD8+ T 細(xì)胞周?chē)乃修D(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了聚類(lèi)，并利用聚類(lèi)算法將其分為九個(gè)模塊（圖 3E ）。值得注意的是，模塊 1 轉(zhuǎn)錄因子包括核受體 ROR-gamma (RORC)、核受體亞家族 1 D 組成員 1 (NR1D1)、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體 gamma (PPARG) 和甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 2 (SREBF2) 在 Tex 中被顯著激活（圖 3F）。

圖3 CD8+ T 細(xì)胞的相互作用網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2. CD8+ T 細(xì)胞衰竭時(shí)效應(yīng)器功能的喪失

Tex 效應(yīng)器功能的喪失可分為三大類(lèi)：（1）細(xì)胞表面 IRS 的上調(diào)；（2）抑制性可溶性因子和環(huán)境因子，如白細(xì)胞介素 10（IL10）、IL4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）和干擾素α/β（IFNα/β）；（3）免疫抑制細(xì)胞（11）。作者研究了不同細(xì)胞類(lèi)型中的免疫檢查點(diǎn)。值得注意的是，IRS（包括抑制性受體 T 細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域 3（TIM3）、淋巴細(xì)胞活化基因 3 蛋白（LAG3）、程序性細(xì)胞死亡蛋白 1（PDCD1）、TIGIT、CD27、細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞蛋白 4（CTLA-4）和腫瘤壞死因子受體超家族成員 9（TNFRSF9））在 Tex 中上調(diào)。富集分析表明，Teff 富集于許多促炎通路，如 IL-2、-3、-17 和 -18 信號(hào)通路，而 Tex 則富集于 IL-4 和 -10 免疫抑制通路以及 PD-1 信號(hào)通路（圖 2B、C）。GSVA 分析證實(shí)了這些結(jié)果（圖 2G）。同時(shí)，偽時(shí)間分析顯示，與 IRS 相關(guān)的基因隨著分化而顯著上調(diào)，如 PD-1 和 CTLA-4。免疫抑制相關(guān)基因如 IL4、IL1RN 和 IL4I1 的表達(dá)增強(qiáng)，而免疫激活相關(guān)基因如 IL18BP 和 IL5RA 的表達(dá)降低。這一發(fā)現(xiàn)與之前的研究結(jié)果一致，即 T 細(xì)胞衰竭通常表現(xiàn)為效應(yīng)功能的逐步喪失。為了進(jìn)一步確定 Tex 與 TME 中其他細(xì)胞之間的相互作用，作者進(jìn)行了 CellChat 分析。首先，作者分析了Tex表達(dá)的免疫抑制受體，包括TIGIT、CTLA-4、ICOS和PDCD1，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞產(chǎn)生不同的配體-受體模式（圖3A）。內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞主要分泌脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（PVR）和NECTIN2，它們作用于Tex表面的TIGIT受體。DC和TAM分泌的CD80和CD86與CTLA-4相互作用。調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Tregs）主要分泌 CD274，作用于 PDCD1。此外，對(duì) PD-L1 通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析表明，Tregs 是 PD-L1 的主要發(fā)送者，而 Tex 則是主要接收者（圖 3B）。此外，PVR 和 NECTIN2 等細(xì)胞因子也參與了腫瘤免疫抑制微環(huán)境的構(gòu)建。對(duì) PVR 通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析表明，腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞是主要的發(fā)送者，而 Tex 等免疫抑制細(xì)胞則是接收者（圖 3D）。更有趣的是，成纖維細(xì)胞亞群在這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著中介作用，這意味著該亞群可能成為新藥的潛在靶點(diǎn)。NECTIN2 通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還顯示了多種配體-受體模式；DCs、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和 TAMs 是主要的發(fā)送者，Tregs、Teff 和 Tex 是主要的接收者（圖 3C）。由于PVR和NECTIN2都能作用于TIGIT，與目前流行的PDL1/PDLD1阻斷劑相比，TIGIT不僅可以逆轉(zhuǎn)CD8 T細(xì)胞的衰竭狀態(tài)，還能在一定程度上改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境。因此，作者假設(shè)抑制 TIGIT 可以成為治療 CRC 的一種新方法。作者的分析表明，Tex 在免疫抑制微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，而 CD8+ T 細(xì)胞的耗竭是 TME 不可避免的結(jié)果。

3. CD8+ T細(xì)胞衰竭過(guò)程中的代謝重塑

作者利用偽時(shí)間分析法構(gòu)建了CD8+ T細(xì)胞的分化軌跡，其中效應(yīng)記憶CD8+ T細(xì)胞出現(xiàn)在分化軌跡的初始位置，逐漸分化為T(mén)eff，最后轉(zhuǎn)化為位于分化軌跡末端的Tex（圖2D）。眾所周知，在癌癥、自身免疫和慢性感染等慢性炎癥情況下，Teff 會(huì)轉(zhuǎn)化為 Tex。因此，作者確定了 Teff 和 Tex 的 DEGs，并進(jìn)行了富集分析（圖 2B、C）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Teff 和 Tex 的代謝模式明顯不同。葡萄糖代謝過(guò)程在 Teff 中富集，而脂質(zhì)生物合成和膽固醇代謝途徑等脂質(zhì)代謝過(guò)程在 Tex 中高度富集。GSVA 也支持這一發(fā)現(xiàn)（圖 2G）。作者提取了在分化軌跡中表達(dá)量增加的基因，然后進(jìn)行了富集分析。脂肪酸生物合成、ω-3、-6 和-9 脂肪酸（FAs）合成等通路均被富集（圖 2E）。這些結(jié)果表明，T細(xì)胞的分化與脂質(zhì)代謝重塑有關(guān)，異常的脂質(zhì)積累可能是Tex的能量來(lái)源。DEGs分析、偽時(shí)間分析和GSVA均表明，PPARG通路在Tex中高表達(dá)。之前的一項(xiàng)研究表明，PPAR 通路在脂質(zhì)和脂蛋白水平的代謝調(diào)節(jié)中被激活?；谶@些結(jié)果，作者推測(cè) Tex 的脂質(zhì)代謝重塑是由于 PPARG 通路的激活所致。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者進(jìn)行了 SCENIC 分析，以揭示 Tex 的異常轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在沒(méi)有懸浮液的情況下，PPARG 在 Tex 中明顯富集。這進(jìn)一步證明了 PPARG 轉(zhuǎn)錄因子可能在 Tex 的脂質(zhì)重編程過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。此外，作者還在 M1 模塊中富集了 RORC、NR1D1 和 SREBF2 轉(zhuǎn)錄因子，它們也與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。作者的研究結(jié)果表明，PPARG 和 SREBF2 等轉(zhuǎn)錄因子（TFs）可能參與了 Tex 的代謝重塑，并成為逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程的潛在靶點(diǎn)。

4. 髓系細(xì)胞

髓系細(xì)胞是TME中豐富的關(guān)鍵組成部分，是多種細(xì)胞類(lèi)型的異質(zhì)混合物，具有刺激和抑制腫瘤的活性。對(duì)髓系細(xì)胞的分析顯示出五個(gè)不同的亞群：?jiǎn)魏思?xì)胞、巨噬細(xì)胞、TAMs、DCs 和肥大細(xì)胞（圖 4A）。其中，巨噬細(xì)胞和 TAMs 在外界條件和刺激因素的影響下可活化并極化為 M1（經(jīng)典活化）和 M2（選擇性活化）表型。M1 細(xì)胞通常表現(xiàn)出促炎癥活性，而 M2 細(xì)胞則表現(xiàn)出以高水平免疫抑制標(biāo)記物和抗炎因子為特征的腫瘤促進(jìn)表型。

圖4 在 CRC 中，巨噬細(xì)胞來(lái)自 M1 極化，而 TAMs 來(lái)自 M2 極化

有趣的是，當(dāng)追溯到組織來(lái)源時(shí)，單核細(xì)胞主要存在于血液中，而巨噬細(xì)胞和 TAMs 則出現(xiàn)在大多數(shù)腫瘤組織中（圖 4A）。偽時(shí)間分析表明，當(dāng)單核細(xì)胞從血液中進(jìn)入 TME 時(shí)分化為巨噬細(xì)胞，最后分化為 TAM（圖 4D）。

5. TAM 參與構(gòu)建免疫抑制微環(huán)境

富集分析表明，巨噬細(xì)胞中富集了與促炎癥相關(guān)的通路，如 IL-1、-2、-3、-11、-17、-18、-21、TNF alpha 和干擾素 alpha/beta 信號(hào)通路，同時(shí)巨噬細(xì)胞還表現(xiàn)出一些類(lèi)似 M2 的功能，如 IL-4、-10 和 TGF-beta 受體信號(hào)通路（圖 4B）。相反，與腫瘤促進(jìn)和免疫抑制相關(guān)的通路在 TAMs 中富集，如花生四烯酸代謝、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、血管內(nèi)皮衍生生長(zhǎng)因子（VEGF）、IL-4、-10、-13 和 PD-1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TAMs 中還存在一些類(lèi)似 M1 的功能通路，如γ干擾素和 TNF 信號(hào)通路。GSVA 分析還顯示，IFN α/β 信號(hào)在 TAMs 中富集，而 IL-5、-6、-7 和-17 則在巨噬細(xì)胞中富集（圖 4C）。總之，巨噬細(xì)胞和 TAMs 表現(xiàn)出混合的 M1 和 M2 表型，其中巨噬細(xì)胞主要表現(xiàn)出 M1 表型，而 TAMs 主要表現(xiàn)出 M2 表型。結(jié)合上述結(jié)果與組織起源和假時(shí)分析，作者推測(cè)單核細(xì)胞從外周血進(jìn)入腫瘤組織后，最初分化為 M1 型巨噬細(xì)胞，最后分化為 M2 型 TAMs，同時(shí)增強(qiáng)了免疫抑制作用。

作者進(jìn)行了 SCENIC 分析，以確定巨噬細(xì)胞向 TAMs 轉(zhuǎn)化過(guò)程中 TFs 的變化（圖 4F、G）。作者發(fā)現(xiàn)，STAT4、NFκB1、NFκB2 和 RUNX1 在巨噬細(xì)胞中富集，其中 STAT4 已被證實(shí)介導(dǎo) JAK-STAT 相關(guān)通路，并參與 IL-12、-21、-23 和 -35 信號(hào)通路的傳導(dǎo)。NFκB1 和 NFκB2 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向 M1 型極化。相反，MAF、ETV5 和 EGR2 在 TAMs 中高表達(dá)，其中 MAF 調(diào)節(jié) IL-4 通路的激活，ETV5 與血管生長(zhǎng)和 IL-10 通路的激活有關(guān) 。研究發(fā)現(xiàn)，EGR2 的表達(dá)與 IL-4 和 TGF-β 功能通路的激活有關(guān)。

最后，作者利用 CellChat 研究了 TAM 與 TME 中其他亞型細(xì)胞之間的相互作用（圖 5D）。與巨噬細(xì)胞相比，TAMs 更多參與了免疫抑制微環(huán)境的構(gòu)建。TAMs 分泌的免疫抑制配體，如 CD80、CD86、CD274、ICOSL 和 NECTIN2 與其他細(xì)胞，尤其是 T 細(xì)胞表達(dá)的 CTLA-4、PD-1、ICOS 和 TIGIT 等受體有明顯的相互作用（圖 5E-G）。除 IRS 外，TAMs 還分泌免疫抑制性可溶性細(xì)胞因子，如 IL-10 和 SPP1（圖 5A）。有趣的是，TAMs 是 IL-10 的主要分泌者，而巨噬細(xì)胞是 IL-10 的主要接受者（圖 5B）。這表明巨噬細(xì)胞和 TAMs 之間可能存在正反饋循環(huán)。一旦巨噬細(xì)胞分化為 TAMs，TAMs 可能會(huì)分泌 IL-10 作用于巨噬細(xì)胞以促進(jìn)分化過(guò)程（圖 5B）。TAMs 還能分泌 SPP1，它能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化并促進(jìn)肺腺癌的免疫逃逸。TAMs分泌的SPP1可與TME中的幾乎所有細(xì)胞相互作用，包括DCs、Tregs、Tex、成纖維細(xì)胞和惡性細(xì)胞（圖5C）。有趣的是，TAM 不僅是 SPP1 的主要分泌者，也是主要接受者。這可能與本研究中 TAMs 的 M2 表型有關(guān)。

圖5 巨噬細(xì)胞與 TAMs 的相互作用網(wǎng)絡(luò)

6. TAMs 中的脂質(zhì)代謝重編程

TAMs 中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因（如 PPARA）高度表達(dá)。為了探索 TAMs 中是否存在類(lèi)似于 T 細(xì)胞衰竭時(shí)的脂質(zhì)代謝重塑，作者提取了巨噬細(xì)胞和 TAMs 的標(biāo)記基因進(jìn)行功能富集分析。結(jié)果顯示，與巨噬細(xì)胞相比，TAMs富集了更多的脂質(zhì)代謝通路，如膽固醇生物合成和脂肪酸代謝，如 "PPAR Alpha通路"。"固醇調(diào)節(jié)元素結(jié)合蛋白（SREBP）對(duì)膽固醇生物合成的調(diào)控 "和 "氧基甾醇受體 LXR-beta (NR1H2) 和氧基甾醇受體 LXR-α (NR1H3) 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)"（圖 4B）。GSVA 還進(jìn)一步證實(shí)了 TAMs 中膽固醇和脂滴合成的增強(qiáng)（圖 4C）。偽時(shí)間分析表明，在巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中，與脂質(zhì)輸出相關(guān)的基因，如 ABCA1 和 ABCG1 的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。作者有理由推測(cè)，巨噬細(xì)胞分化成 TAMs 的過(guò)程伴隨著脂質(zhì)代謝的重塑。

在TAMs中富集的功能通路中，有三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子引起了作者的注意，即SREBF、NR1H2和NR1H3。進(jìn)一步的 SCENIC 分析報(bào)告了 TAMs 中異常的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。如圖 4G 所示，模塊 1 中的轉(zhuǎn)錄因子在 TAMs 中被顯著激活，其中包括 SREBF 和 NR1H3。其中，SREBF 的功能是轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與脂質(zhì)生物合成和吸收的基因，促進(jìn)脂肪酸合成并誘導(dǎo) TAMs 的 M2 表型。NR1H2 和 NR1H3 是參與脂質(zhì)代謝合成的轉(zhuǎn)錄因子，在轉(zhuǎn)錄水平上是 SREBP-1c 通路的重要調(diào)節(jié)因子，它們調(diào)節(jié)肝臟致脂細(xì)胞中與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和外流相關(guān)的基因表達(dá)。作者對(duì) NR1H2 和 NR1H3 介導(dǎo)的膽固醇外流功能特別感興趣。膽固醇外流的增加增加了 TME 中的脂質(zhì)含量，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了營(yíng)養(yǎng)，并破壞了 TAM 的脂質(zhì)筏，削弱了 Toll 樣受體 4（TLR4）信號(hào)通路。它還增強(qiáng)了IL-4通路，削弱了干擾素通路，并在TAMs極化為M2方面發(fā)揮了意想不到的作用。作者推測(cè)，TAMs 中脂質(zhì)代謝的重編程在一定程度上參與了免疫功能的重塑。

因此，SREBF和NR1H3在TAMs的脂質(zhì)代謝重塑中發(fā)揮著重要作用。TAMs和Tex都經(jīng)歷了脂質(zhì)代謝重塑，反映了脂質(zhì)代謝在T細(xì)胞衰竭和TAMs極化為M2型過(guò)程中的重要作用。然而，這兩種細(xì)胞之間存在著顯著的差異，主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的不同上。因此，作者懷疑SREBF和NR1H3可能是防止或逆轉(zhuǎn)TAMs極化為M2的重要靶點(diǎn)。

7. 新陳代謝重塑和免疫抑制微環(huán)境構(gòu)建

DCs 表現(xiàn)出與 TAMs 相似的模式 DCs 是免疫系統(tǒng)中最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的核心參與者。DEGs分析顯示，DCs高表達(dá)免疫抑制細(xì)胞因子，如IL-4、-10和IFNα/β。進(jìn)一步的富集分析表明，IL-4、-10和-13、干擾素α/β、PD-1和CTLA-4抑制信號(hào)通路在DC中富集（圖4B）。CellChat 分析發(fā)現(xiàn)，DCs 在分泌免疫抑制細(xì)胞因子方面表現(xiàn)出與 TAMs 相似的模式，尤其是 ICSO（圖 5E）、CD80（圖 5F）和 CD86（圖 5G）。這些熱圖表明，DC 和 TAM 是參與 CD8+ T 細(xì)胞衰竭過(guò)程的主要分泌物，它們協(xié)同促進(jìn)了免疫抑制微環(huán)境的構(gòu)建。

同時(shí)，富集分析表明，脂質(zhì)代謝、脂肪酸代謝和 PPARA 信號(hào)通路在 DCs 中高度富集（圖 4B）。除了異常的脂質(zhì)儲(chǔ)存外，PPARs 通路還增強(qiáng)了 TCA 循環(huán)，導(dǎo)致檸檬酸積累。這些條件為脂肪酸和細(xì)胞內(nèi)脂滴的從頭合成提供了底物。其他途徑也得到了豐富，包括 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)和 CDK-beta-catenin 活性。事實(shí)證明，Wnt5可作用于DC上的Frizzled（FZD）家族受體，并通過(guò)激活β-catenin信號(hào)觸發(fā)下游PPAR通路的激活，從而重塑黑色素瘤的脂質(zhì)代謝（圖4B）。RUNX2和RUNX3對(duì)Wnt信號(hào)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在DC中富集。SCENIC 分析表明，RUNX2 在 DCs 中高表達(dá)。這些結(jié)果表明，DCs的脂質(zhì)代謝重塑可能也依賴(lài)于RUNX家族調(diào)控的核心Wnt/β-catenin/PPAR信號(hào)通路?；谏鲜龇治?，作者推測(cè)，DC 的脂質(zhì)代謝重編程參與了免疫抑制微環(huán)境的重建。

8. 成纖維細(xì)胞

作者提取了 145 個(gè)成纖維細(xì)胞，并將其分為兩組：成纖維細(xì)胞-1 和成纖維細(xì)胞-2（圖 6A、B）。偽時(shí)間分析顯示，成纖維細(xì)胞-1 出現(xiàn)在分化軌跡的初始階段，而成纖維細(xì)胞-2 則出現(xiàn)在分化軌跡的末端。有趣的是，成纖維細(xì)胞-2 也分化成兩種不同的亞型，即狀態(tài) 2 和狀態(tài) 3（圖 6C）。

圖6 成纖維細(xì)胞中類(lèi)似的代謝和功能重塑

9. 成纖維細(xì)胞中相似的代謝和功能重塑

富集分析表明，與成纖維細(xì)胞-1 相比，成纖維細(xì)胞-2 更多參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解和受 MET 信號(hào)通路調(diào)控的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（圖 6D）。有趣的是，兩個(gè)集群之間的代謝模式完全不同。成纖維細(xì)胞-2 顯著富集了與脂質(zhì)膽固醇和脂肪酸代謝相關(guān)的通路。相比之下，成纖維細(xì)胞-1 表現(xiàn)出碳水化合物代謝模式（圖 6E）。此外，成纖維細(xì)胞-2 的兩個(gè)亞組都表現(xiàn)出 ECM 調(diào)節(jié)和脂質(zhì)代謝模式，而狀態(tài) 2 亞組與狀態(tài) 3 相比，表現(xiàn)出更強(qiáng)的脂質(zhì)代謝重塑、ECM 降解和受 MET 信號(hào)通路調(diào)控的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)促進(jìn)模式（圖 6F）。其中，幾個(gè)在成纖維細(xì)胞-2 中高度富集的通路引起了作者的注意，如 "NR1H2&NR1H3 調(diào)節(jié)與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和外流相關(guān)的基因表達(dá)"、"NR1H2 和 NR1H3 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) "和 "RUNX2 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控"。SCENIC 分析還顯示，NR1H2、NR1H3 和 RUNX 在成纖維細(xì)胞-2 中上調(diào)。這與 TAMs 的情況高度一致。以上結(jié)果表明，在成纖維細(xì)胞-1 向成纖維細(xì)胞-2 的分化過(guò)程中，也可能出現(xiàn)脂質(zhì)代謝增強(qiáng)和脂質(zhì)異常積累的現(xiàn)象。

10. 腫瘤教育免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)與 CRC 預(yù)后較差有關(guān)

作者使用 CIBERSORTx 進(jìn)行了數(shù)字細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，以評(píng)估之前從癌癥基因組圖譜-結(jié)腸腺癌（TCGA-COAD）數(shù)據(jù)中分析的患者腫瘤基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞亞群的豐度。作者利用逐步回歸法建立了一個(gè)新的風(fēng)險(xiǎn)模型，以評(píng)估細(xì)胞分型與預(yù)后結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)，并確定訓(xùn)練隊(duì)列中每個(gè)亞組的最佳系數(shù)。最后，作者選擇了 16 個(gè)亞組構(gòu)建模型。

然后，作者評(píng)估了風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)總生存期（OS）的預(yù)后價(jià)值。在訓(xùn)練隊(duì)列和測(cè)試隊(duì)列中，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的 OS 明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組（分別為 p<0.001 和 p=0.03）（圖 7A、B）。該模型的準(zhǔn)確性通過(guò)與時(shí)間相關(guān)的接收者操作特征曲線（ROC）得到了驗(yàn)證，這證實(shí)了兩個(gè)隊(duì)列的預(yù)后的可靠性。在訓(xùn)練隊(duì)列中，1、2 和 3 年 OS 的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分 ROC 曲線下面積分別為 0.823、0.774 和 0.696，而在測(cè)試隊(duì)列中分別為 0.709、0.709 和 0.711。(圖 7C、D）。此外，作者使用逐步多變量 Cox 回歸法構(gòu)建了一個(gè)新的臨床模型，在訓(xùn)練隊(duì)列中納入了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、TNM 分期、性別和年齡，并選擇風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和 TNM 分期來(lái)構(gòu)建模型。

圖7 腫瘤教育免疫細(xì)胞的滲透與 CRC 預(yù)后惡化有關(guān)

有趣的是，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和 TNM 分期都是獨(dú)立的預(yù)后因素（分別為 p<0.001 和 p=0.038）。根據(jù)臨床風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)，患者被分為兩個(gè)亞組。KM生存分析顯示，在訓(xùn)練組和測(cè)試組中，高臨床風(fēng)險(xiǎn)型患者的OS明顯低于低臨床風(fēng)險(xiǎn)型患者（分別為p<0.001和p=0.0012）（圖7E、F）。在訓(xùn)練隊(duì)列中，1 年、2 年和 3 年 OS 的 ROC 曲線下面積分別為 0.885、0.746 和 0.734，而在測(cè)試隊(duì)列中，1 年、2 年和 3 年 OS 的 ROC 曲線下面積分別為 0.827、0.780 和 0.780。(圖 7G 和 H），優(yōu)于免疫風(fēng)險(xiǎn)模型。

作者還應(yīng)用了其他已報(bào)道的免疫風(fēng)險(xiǎn)模型和TNM分期進(jìn)行驗(yàn)證。高危/高分期（III-IV期）組患者的OS明顯差于低危/低分期（I-II期）組（分別為p<0.001和p=0.015）（圖S6B和S6A）。免疫風(fēng)險(xiǎn)模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在1年、2年和3年OS的ROC曲線下面積分別為0.758、0.760和0.717，而TNM分期模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在1年、2年和3年OS的ROC曲線下面積分別為0.726、0.636和0.650（圖S6D、S6C）。

總結(jié)

該研究進(jìn)一步揭示了TME的異質(zhì)性和趨同性，尤其是各細(xì)胞亞群分化過(guò)程中高度一致的脂質(zhì)代謝重塑和免疫抑制表型，為結(jié)直腸癌的靶向治療和免疫治療提供了新的視角。同時(shí)，利用CIBERSORTx算法整合scRNA-seq和大量RNA-seq數(shù)據(jù)，構(gòu)建了免疫風(fēng)險(xiǎn)模型和臨床風(fēng)險(xiǎn)模型，為結(jié)直腸癌患者的預(yù)后分析提供了參考價(jià)值。總之，這項(xiàng)研究為理解TME的異質(zhì)性和趨同性提供了一個(gè)新的視角，將有助于開(kāi)發(fā)治療CRC的免疫療法。