不依賴CRISPR的全新堿基編輯工具

醫(yī)學(xué)abeycd 2023-09-11

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基于轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)(TALE)的工具用于細(xì)胞核和細(xì)胞器DNA的堿基編輯，依賴于雙鏈DNA脫氨酶，它編輯兩條DNA鏈上的底物堿基，降低了編輯精度。

2023年8月28日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團(tuán)隊聯(lián)合北京齊禾生科生物科技有限公司在Nature Biotechnology 在線發(fā)表題為“Strand-preferred base editing of organellar and nuclear genomes using CyDENT”的研究論文，該研究提出了CyDENT堿基編輯，一個無 CRISPR、鏈選擇性、模塊化堿基編輯器。

CyDENT包括一對與FokI酶，單鏈特異性胞苷脫氨酶和外切酶融合的TALEs，以產(chǎn)生用于脫氨的單鏈DNA底物。該研究在細(xì)胞核、線粒體和葉綠體基因組中展示了有效的堿基編輯。在某些線粒體位點，顯示編輯效率為14%，鏈特異性為95%。此外，通過將CyDENT脫氨酶與更傾向于編輯GC基序的酶交換，作者在其他方法無法編輯的位點上展示了高達(dá)20%的線粒體堿基編輯。CyDENT的模塊化特性為各種應(yīng)用程序提供了一套定制的基礎(chǔ)編輯器。

線粒體是基本的半自主細(xì)胞器，擁有自己的基因組。人類線粒體基因組是一個16.6 kb的雙鏈環(huán)狀DNA(線粒體DNA (mtDNA))，包含37個基因，編碼13個呼吸鏈復(fù)合物亞基、2個RNAs和22個轉(zhuǎn)移RNAs (tRNAs)。根據(jù)mitomap數(shù)據(jù)，在mtDNA中發(fā)現(xiàn)了超過19,500個單核苷酸變異(SNVs)，其中超過250個被認(rèn)為與疾病相關(guān)，包括Leber 's遺傳性視神經(jīng)病變，Leigh 's綜合征，進(jìn)行性腦肌病，MELAS等?；贑RISPR的基因組編輯技術(shù)，包括CRISPR-Cas核酸酶、堿基編輯器和初始編輯器，是能夠固定不同核基因組變異的強(qiáng)大工具；然而，這些工具不能有效地編輯mtDNA，因為單導(dǎo)RNA無法傳遞到線粒體。

CyDENT堿基編輯的示意圖概述（圖源自Nature Biotechnology）

最近，兩種基于蛋白質(zhì)的工具，雙鏈DNA脫氨酶(DddA)衍生的胞嘧啶堿基編輯器(DdCBE) 和TALE-linked脫氨酶(TALED)被開發(fā)出來，可以在mtDNA中進(jìn)行精確的堿基編輯。DdCBE和TALED都依賴于DddA，一種雙鏈DNA (dsDNA)脫氨酶，以分裂形式融合到一對TALE蛋白上，以指導(dǎo)可編程的堿基編輯。雖然DdCBE和TALED都可以分別在mtDNA中進(jìn)行高效的C·G到T·A和A·T到G·C堿基轉(zhuǎn)換，但這些編輯器對DNA靶鏈特異性缺乏任何精度。由于DddA蛋白在指導(dǎo)任何堿基轉(zhuǎn)換中都是必不可少的，它靶向DNA兩條鏈上的底物堿基，從而使目標(biāo)DNA兩條鏈上的胞嘧啶和腺嘌呤堿基被編輯，從而導(dǎo)致額外的不希望的突變。因此，有必要開發(fā)鏈特異性的無CRISPR堿基編輯器，以便基于蛋白質(zhì)系統(tǒng)在細(xì)胞器和核DNA中進(jìn)行精確的堿基轉(zhuǎn)換。

該研究提出了一個模塊化的堿基編輯系統(tǒng)，胞苷脫氨酶-核酸外切酶-鎳酶-TALE (CyDENT)，它執(zhí)行無CRISPR、鏈選擇性DNA編輯。CyDENT是由一對可編程的TALE蛋白、單鏈DNA (ssDNA)脫氨酶、缺口酶和核酸外切酶組成的模塊化組裝體。重要的是，CyDENT在人類細(xì)胞中實現(xiàn)了高效和鏈選擇性的線粒體堿基編輯。

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組博士后胡佳成，碩士生孫瑜，博士生李帛樹為該論文的并列第一作者；高彩霞研究員與齊禾生科生物科技有限公司的Kevin Tianmeng Zhao博士為本文共同通訊作者。該研究得到了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)專項、國家重點研發(fā)計劃項目、國家自然科學(xué)基金等項目的資助。