Western blot免疫印跡（以下簡稱WB）實驗作為檢測蛋白表達(dá)相對定量的技術(shù)，在完成Western blot實驗后，得到的是蛋白條帶，還需要再對Western blot條帶進行結(jié)果處理。對于WB結(jié)果處理的過程，主要分為3個部分:

1.    用PS軟件進行排版；

2.    用image J進行灰度值分析；

3.    用prism軟件進行作圖分析。

一、 用PS對WB圖片排版

1.    打開PS軟件，如下圖需要處理β-actin蛋白和Xprotein蛋白，將WB灰度圖一起拉到PS中 ：

2.    有一些條帶會出現(xiàn)傾斜的情況，會影響美觀，因此我們需要將條帶拉直至在在同一水平線上。選擇【標(biāo)尺工具】，對著WB條帶的首尾畫一條直線，接著點擊【拉直圖層】，圖片即可呈現(xiàn)水平狀態(tài)。

 拉直后的wb條帶圖

拉直后的wb條帶圖

3.    在不改變臺條帶趨勢的情況下，可以對條帶進行曝光度調(diào)整（圖像-調(diào)整-曝光度）；

4.    新建畫布，點擊文件-新建畫布即可新建。新建大小可以根據(jù)PS的默認(rèn)大小來新建，也可以自己自定義畫布大小。

5.    點擊【矩形選擇框工具】-選中條帶，點擊【移動工具】，點擊選中的條帶，將條帶拖至新建的畫布中（或者復(fù)制選中的條帶后，再到新建畫布中粘貼也可以）。

6.    同樣的方法，我們可以將第二個條帶或第三個條帶拖新建的畫布中，快捷方式ctrl+t可以調(diào)整圖片大小，拖動圖片使圖片條帶對齊即可。下圖的圖層1和圖層2對應(yīng)的是拉進來的2個蛋白圖。

7.    描邊。選擇對應(yīng)的蛋白條帶圖后，點擊編輯-描邊，這里選擇1像素，選擇太高像素邊框會加粗。

8.    最后標(biāo)注就可以了。點擊文字工具，可以選擇選擇橫排文具工具或者豎排文字工具，選擇合適的字體大小，再在需要標(biāo)注的單擊即可進行文字編輯。

9.    調(diào)整圖片大小，保存圖片。如圖畫布太大，可以通過裁剪工具裁掉一部分的畫布，最后通過“文件“-”儲存為“，選擇對應(yīng)的圖片格式保存圖片。

二、 灰度值分析

1. 打開image J軟件，打開以上排版好的WB圖；

2. 轉(zhuǎn)為灰度圖片：點擊image- type-8 bit

3. 設(shè)計參數(shù)：點擊analysis-set measurments

4. 設(shè)計單位：點擊analysis-set scale ，選擇pixel單位

5. 分析條帶：選擇矩形選框工具，框住條帶，點擊Analysis-Gels-Selecit First Lane（或快捷鍵control +1）

6. 再次點擊Analysis-Gels-Plot Lanes（或快捷鍵control +3）

7. 封閉開口：選擇直線工具，畫下直線，將開口封住

10.  得出數(shù)據(jù)：選擇魔棒工具，依次點擊各個框，即可得到相對應(yīng)的灰度值數(shù)據(jù)

11.  復(fù)制數(shù)值至excel 表格。

三、 數(shù)據(jù)分析

1.    對于我們得到的數(shù)據(jù)，可以將目的蛋白的條帶數(shù)值/內(nèi)參條帶的數(shù)值，再將得出的數(shù)值以對照組數(shù)據(jù)為參考做均一化處理，即可得到表達(dá)趨勢值。

2.    我們可以將得到的數(shù)值標(biāo)注在wb條帶的下方，如果進行了3次重復(fù)實驗，也可以通過prism軟件進行數(shù)據(jù)處理，做成柱狀圖并進行統(tǒng)計學(xué)分析。對于分析方法，可以參考紐萬生物發(fā)表的《運用Graphpad prism軟件繪制柱狀圖》文章，即可做出對應(yīng)的柱狀圖和進行統(tǒng)計學(xué)分析。