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NA測(cè)序（RNA-Seq）是基于二代測(cè)序技術(shù)開展轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究過(guò)程中廣泛使用的一種方法，能夠在特定時(shí)間點(diǎn)對(duì)生物樣本中的多種RNA進(jìn)行定性和定量分析。針對(duì)RNA測(cè)序的常規(guī)建庫(kù)方法都需要先將RNA轉(zhuǎn)換為雙鏈DNA，且需經(jīng)過(guò)目標(biāo)RNA富集及片段化、雙鏈DNA合成、接頭連接、PCR擴(kuò)增等多個(gè)步驟。
Tn5轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體因能一步打斷雙鏈DNA并且使DNA兩端帶上接頭，而廣泛應(yīng)用于二代測(cè)序建庫(kù)等領(lǐng)域。近期也有研究發(fā)現(xiàn)，Tn5轉(zhuǎn)座酶同樣能以類似的方式作用于RNA/DNA雜合鏈，從而能夠省去傳統(tǒng)RNA建庫(kù)技術(shù)中的RNA片段化、二鏈合成等繁瑣的操作步驟，進(jìn)一步拓展了Tn5轉(zhuǎn)座酶的新用途。此外，Tn5轉(zhuǎn)座酶也被廣泛用于體外轉(zhuǎn)基因(外源基因整合到宿主細(xì)胞)等各領(lǐng)域。
NGS? Tn5轉(zhuǎn)座酶是一種來(lái)源于E.coli、經(jīng)過(guò)改造具有極高活性的Tn5轉(zhuǎn)座酶突變體，可以高效地將Tn5轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入到目標(biāo)序列，對(duì)于真核和原核生物的DNA都有極高的轉(zhuǎn)座插入效率。與野生型Tn5轉(zhuǎn)座酶相比，其插入效率至少提升1000倍，具有轉(zhuǎn)座隨機(jī)性好、穩(wěn)定性高、插入位點(diǎn)易測(cè)序等特點(diǎn)。
產(chǎn)品原理：
本產(chǎn)品可以特異性識(shí)別兩端含有嵌合末端序列(Mosaic End sequence, ME)的DNA片段(包括含有ME序列的引物)，最終形成Tn5轉(zhuǎn)座體，該轉(zhuǎn)座體可以隨機(jī)結(jié)合靶DNA并切割插入其攜帶的DNA片段。
圖1. NGS? Tn5 Transposase的工作原理圖。
產(chǎn)品用途：
二代測(cè)序(NGS)文庫(kù)構(gòu)建時(shí)的片段化和加接頭；
將測(cè)序引物引入克隆DNA或質(zhì)粒；
細(xì)菌基因敲除庫(kù)的建立；
新型細(xì)菌菌株工程改造；
目的基因的插入失活；
將T7轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、抗性標(biāo)記等插入靶DNA等。
使用說(shuō)明：
1.體外轉(zhuǎn)座子插入反應(yīng)和轉(zhuǎn)化。
a.Tn5轉(zhuǎn)座子的設(shè)計(jì)。Tn5轉(zhuǎn)座子是兩側(cè)帶有19bp ME序列的DNA片段，可以使用含有ME序列的上下游引物進(jìn)行PCR合成。為了獲得最佳的轉(zhuǎn)座效率，在兩端的PCR引物中需要添加一個(gè)5'磷酸基團(tuán)。典型的Tn5轉(zhuǎn)座子參考圖2。
ME序列: 5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'
圖2. Tn5轉(zhuǎn)座子示意圖。Tn5轉(zhuǎn)座子其兩端為19bp ME序列，ME序列可被BeyoNGS? Tn5轉(zhuǎn)座酶特異性識(shí)別。
b.按照下表制備轉(zhuǎn)座子插入混合物。配制過(guò)程中需要注意目標(biāo)DNA純度，確保無(wú)外源核酸污染。
| Component |
Volume |
| Reaction Buffer (5X) |
2μl |
| Target DNA* |
0.2μg |
| molar equivalent Tn5 Transposon |
x μl |
| BeyoNGS? Tn5 Transposase (40μM) |
1μl |
| ddH2O |
To 10μl |
*注：為了避免多余片段的插入，需要計(jì)算反應(yīng)中使用的目標(biāo)DNA摩爾數(shù)，并加入等摩爾量的Tn5轉(zhuǎn)座子片段以減少產(chǎn)生過(guò)多插入的可能性。μmol target DNA=μg target DNA/[(base pairs in target DNA)×660]，例如：0.2μg 5000bp的目標(biāo)DNA = 0.2μg/ [5000bp×660]=0.06×10-6μmol = 0.06pmol。
c.混勻后37℃孵育2小時(shí)。
d.加入2μl Stop Buffer (5X)，混勻后55℃孵育10分鐘終止反應(yīng)。
e.取1μl混合物電擊轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，根據(jù)抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性菌株。未使用的混合物可以-20℃保存。推薦的電擊轉(zhuǎn)化條件：50μl感受態(tài)細(xì)胞，1μl混合物，2毫米電擊杯，2500V，電擊時(shí)間5毫秒。轉(zhuǎn)化條件可根據(jù)該條件的轉(zhuǎn)化效果進(jìn)行優(yōu)化。轉(zhuǎn)座的克隆數(shù)主要取決于所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、內(nèi)源性的限制修飾系統(tǒng)及感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。
2.BeyoNGS? Tn5轉(zhuǎn)座體復(fù)合物( BeyoNGS? Tn5 Transposome complex)的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化后的體內(nèi)插入。
a.按照下表依次加入相應(yīng)試劑，制備Tn5轉(zhuǎn)座體復(fù)合物混合物。
| Component |
Volume |
| Tn5 Transposon DNA (100μg/ml in TE Buffer) |
2μl |
| BeyoNGS? Tn5 Transposase (40μM) |
4μl |
| Glycerol (100%) |
2μl |
| Total Reaction Volume |
8μl |
注1：本反應(yīng)無(wú)須Mg2 催化，請(qǐng)勿使用D7102-2 Reaction Buffer (5X)。
注2：參考1a中Tn5的轉(zhuǎn)座子設(shè)計(jì)，Tn5 Transposon DNA為含選擇標(biāo)記(如抗性標(biāo)記)、成對(duì)識(shí)別序列(如ME序列)和目標(biāo)基因的雙鏈DNA，可通過(guò)PCR等方法獲得。
注3：本反應(yīng)體系可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行放大或縮小。
b.混勻后室溫孵育0.5-1小時(shí)。
c.取1μl的轉(zhuǎn)座體復(fù)合物電擊轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，在體內(nèi)進(jìn)行插入，并根據(jù)抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性菌株。推薦的電擊轉(zhuǎn)化條件：50μl感受態(tài)細(xì)胞，1μl轉(zhuǎn)座體復(fù)合物 ，2毫米電擊杯，2500V，電擊時(shí)間5毫秒。轉(zhuǎn)化條件可根據(jù)該條件的轉(zhuǎn)化效果進(jìn)行優(yōu)化。轉(zhuǎn)座的克隆數(shù)主要取決于所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、內(nèi)源性的限制修飾系統(tǒng)及感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。
d.構(gòu)建好的轉(zhuǎn)座體復(fù)合物-20℃可以保存1年。
3.構(gòu)建二代測(cè)序所需的BeyoNGS? Tn5轉(zhuǎn)座體( BeyoNGS? Tn5 Transposome)。
a.ME和接頭(Adapters)的序列。
ME: 5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'
Primer 1: 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'
Primer 2: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'
注：本接頭序列參考Nextera? DNA Sample Preparation Kit (Illumina, FC-121-1030)，也可按照不同高通量測(cè)序的要求進(jìn)行設(shè)計(jì)。
b.制備Adapter 1和Adapter 2。
按照下表分別配制Adapter 1和Adapter 2退火反應(yīng)體系。退火反應(yīng)后Adapter 1或Adapter 2的終濃度為200μM。
| Component |
Volume |
| Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) (D0251) |
10μl |
| ME (500μM) |
20μl |
| Primer-1 or 2 (500μM) |
20μl |
| Total Reaction Volume |
50μl |
在PCR儀設(shè)置退火反應(yīng)程序：
| Step |
Temperature |
| 1 |
95℃, 2min |
| 2 |
95℃, 8s, -0.1℃ per cycle |
| 3 |
GOTO step 2, 700 cycles |
| 4 |
4℃ forever |
c.BeyoNGS? Tn5轉(zhuǎn)座體的制備。
按照下表，將BeyoNGS? Tn5轉(zhuǎn)座酶、Adapter 1和Adapter 2爾比1:0.5:0.5混合，吹打混勻，室溫孵育1小時(shí)。注：可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)提高Tn5轉(zhuǎn)座酶的混合比例，但Adapter 1和Adapter 2的濃度需要保持一致。制備好Tn5轉(zhuǎn)座體可直接用于DNA片段化實(shí)驗(yàn)，也可以-20℃保存。
| Component |
Volume |
| BeyoNGS? Tn5 Transposase |
10μl |
| Adapter 1 (200μM) |
1μl |
| Adapter 2 (200μM) |
1μl |
d.片段化(Tagmentation)效果測(cè)試。
按照下表配制反應(yīng)體系，輕輕吹打混勻后，55℃孵育5-10分鐘。隨后加入5μl Stop Buffer (5X)，混勻后55℃孵育5分鐘終止反應(yīng)，片段化的產(chǎn)物可用于檢測(cè)或純化后建庫(kù), 效果參考圖3。根據(jù)打斷片段的大小調(diào)整復(fù)合體用量，如果片段過(guò)長(zhǎng)，增加轉(zhuǎn)座體的使用量；如果片段過(guò)短，則減少轉(zhuǎn)座體的使用量。
| Component |
Volume |
| DNA |
50-100ng |
| Tn5轉(zhuǎn)座體 |
0.5-2μl |
| Reaction Buffer (5X) |
4μl |
| ddH2O |
To 20μl |
圖3. 使用NGS? Tn5 Transposase制備的Tn5轉(zhuǎn)座體用于DNA隨機(jī)片段化的效果測(cè)試圖。在20μl反應(yīng)體系中，加入100ng Lambda DNA及相應(yīng)量的Tn5轉(zhuǎn)座體，55℃孵育10分鐘，反應(yīng)完畢入5μl Stop Buffer (5X)，混勻后55℃孵育5分鐘終止反應(yīng)，加入5μl DNA上樣緩沖液(6X) ，使用 瓊脂糖預(yù)制膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。實(shí)際效果會(huì)因樣品種類、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
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