本發(fā)明涉及植物有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種苦楝素的提取方法。

背景技術(shù)：

苦楝素又被稱為印楝素，主要是從苦楝樹的皮和果實中提取而來，具有多種生理活性，其主要成分為四環(huán)三萜類物質(zhì)，具有一定的醫(yī)藥治療作用，并有著良好的廣譜殺蟲抗菌性能，對人體無損，易于降解，可以用來防治農(nóng)作物病蟲害，是一種極具潛力的植物源農(nóng)藥。

目前苦楝素的提取的方法主要為常規(guī)浸提法、超聲提取法、微波法、快速萃取法、超臨界和亞臨界溶劑法等，但是上述方法都存在不同程度的弊端，具體主要表現(xiàn)在浸提法中以乙醇為溶劑萃取法產(chǎn)率低；利用有機溶劑的快速萃取法得到的苦楝素產(chǎn)品含有多種油性成分殘留，雜質(zhì)較多；超臨界和亞臨界提取法中的高溫工藝會對印楝素的有效化學(xué)活性產(chǎn)生破壞作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種苦楝素的提取方法，提取條件溫和，操作簡單、提取率高，適合工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)需求。

本發(fā)明采取的具體方案如下：

一種苦楝素的提取方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1，將苦楝皮或苦楝種子洗凈、烘干，粉碎至100-200目，將得到的苦楝粉末溶于水后再加入纖維素酶和果膠酶，調(diào)節(jié)ph值為3.5-5.5，40-50℃反應(yīng)1-3h，過濾得到濾液1和濾渣1；

步驟2，取濾渣1，加至ph值為2.0-3.0緩沖液中，混勻萃取，過濾得到濾渣2和濾液2；

步驟3，取濾渣2，加至ph值為5.0-7.0緩沖液中，混勻萃取，過濾得到濾渣3和濾液3；

步驟4，取濾渣3，加至ph值為8.0-8.5緩沖液中，混勻萃取，過濾得到濾渣4和濾液4；

步驟5，將步驟1至4得到的濾液1、濾液2、濾液3和濾液4合并，萃取后，得到上層水相；

步驟6，膜分離提純：利用膜分離技術(shù)對步驟5中得到的水相液體進行膜分離工藝，得到截留后的的溶液，

步驟7，將步驟6得到的截留溶液低溫濃縮成苦楝素濃溶液。

優(yōu)選地，步驟1中苦楝粉末與水的質(zhì)量比為1：50-100。

優(yōu)選地，步驟1中纖維素酶、果膠酶和苦楝粉末的質(zhì)量比為1:1:10-20。

優(yōu)選地，步驟1中用超聲波技術(shù)輔助苦楝粉末溶解，超聲場的超聲功率為100w-400w，超聲頻率為20khz-80khz。

優(yōu)選地，步驟2中ph值為2.0-3.0緩沖液選自磷酸氫二鈉-磷酸緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液或醋酸-醋酸銨緩沖液；步驟3中ph值為5.0-7.0緩沖液選自鄰苯二甲酸-氫氧化鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液或磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液；步驟4中ph值為8.0-8.5緩沖液選自氨水-氯化銨緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液。

優(yōu)選地，步驟2-4中使用超聲波技術(shù)輔助萃取，超聲場的超聲功率為100w-400w，超聲頻率為20khz-80khz。

優(yōu)選地，步驟5中的萃取溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷。

優(yōu)選地，步驟6中膜分離是選用分子量≤1000da的分離膜，膜分離的操作溫度為20℃-40℃、操作壓力為0.3mpa-1.5mpa；

優(yōu)選地，步驟7中低溫濃縮是低溫蒸發(fā)濃縮，蒸發(fā)溫度在50℃-60℃。

本發(fā)明采用“半仿生”-膜分離結(jié)合提取苦楝素?！鞍敕律笔悄７驴诜幬镌谖改c道的轉(zhuǎn)運過程和在動物胃腸道中的存在環(huán)境，其中胃液ph為2.0-3.5、小腸液ph為5.0-7.0、大腸液ph為7.5-8.5。采用選定ph的酸性水和堿性水依次連續(xù)提取，其目的是提取含指標成分高的“活性混合物”。

本發(fā)明首先利用半仿生技術(shù)，采用不同ph值的酸溶液、中性溶液、堿溶液提取藥材，模擬動物內(nèi)的胃腸道吸收環(huán)境，使得動物體可吸收利用成分提取完全，與傳統(tǒng)的提純分離方法相比，提取條件溫和，操作簡單、提取率高，適合工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)需求；還利用膜分離技術(shù)對已經(jīng)分離的苦楝素溶液進行二次提純，優(yōu)選截取分子量≤1000da的苦楝素大分子，原因是分子量≤1000da的最終產(chǎn)物具有較好的藥理作用，同時更加有利于動物體的高效吸收。

此外，本發(fā)明在提取過程中還加入了生物酶，利用纖維素酶和果膠酶的降解作用破壞苦楝皮或苦楝種子粉末中含有的纖維素和果膠質(zhì)，破壞其結(jié)構(gòu)，使其更加疏松，加速苦楝素的溶出速率，更加有利于苦楝素的萃取，大大提升萃取效率和萃取率。

在萃取過程中采用超聲波技術(shù)，利用超聲波的機械效應(yīng)、空化效應(yīng)和內(nèi)加熱作用，可有效地使細胞壁破裂，增加苦楝素在溶劑中的溶解度，提高其擴散速度和浸出過程中的濃度梯度，加速有效成分的溶出，實現(xiàn)高效率提取。

本發(fā)明創(chuàng)造性地采用半仿生技術(shù)對苦楝素原料進行分離萃取，得到有效成分較高的能夠被動物體吸收的川楝素溶液；后結(jié)合膜分離截取技術(shù)得到分子量≤1000da苦楝素產(chǎn)物，在半仿生技術(shù)和膜分離技術(shù)協(xié)同作用下，使得最終得到的苦楝素產(chǎn)物有效成分含量更高。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步說明。

實施例1

將苦楝皮洗凈、烘干，粉碎至100-200目，加水混合，苦楝粉末與水的質(zhì)量比為1:50；充分混合后，加入纖維素酶和果膠酶，纖維素酶和果膠酶和苦楝粉末的質(zhì)量比為1:1:20，調(diào)節(jié)混合體系調(diào)節(jié)ph值為3.5-5.5，溫度為40-50℃，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分反應(yīng)2h后，過濾得到濾液1和濾渣1。

將濾渣1加入到ph值為2.2的磷酸氫二鈉-磷酸緩沖溶液中，常溫下混合均勻，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分萃取2h后過濾的濾液2和濾渣2；將濾渣2加入到ph值為5.5的鄰苯二甲酸-氫氧化鈉緩沖溶液中，常溫下混合均勻，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分萃取2h后過濾的濾液3和濾渣3；將濾渣3加入到ph值為8.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液中，常溫下混合均勻，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分萃取2h后過濾的濾液4和濾渣4。

將濾液1-4合并，用乙醇萃取，靜置，分層后，取上層水相，重復(fù)上述操作3次；將上述步驟得到的水相溶液加入到膜分離設(shè)備中再次進行分離提純，優(yōu)選截取分子量≤1000da的超濾膜，調(diào)節(jié)膜分離操作溫度為20℃、操作壓力為0.3mpa-0.5mpa；將截留溶液轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)濃縮設(shè)備，攪勻，靜置，過濾，并低溫濃縮成苦楝素濃溶液。

實施例2

將苦楝種子洗凈、烘干，粉碎至100-200目，加水混合，苦楝粉末與水的質(zhì)量比為1:80；充分混合后，加入纖維素酶和果膠酶，纖維素酶和果膠酶和苦楝粉末的質(zhì)量比為1:1:15，調(diào)節(jié)混合體系調(diào)節(jié)ph值為3.5-5.5，溫度為40-50℃，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分反應(yīng)2h后，過濾得到濾液1和濾渣1。

將濾渣1加入到ph值為2.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，常溫下混合均勻，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分萃取2h后過濾的濾液2和濾渣2；將濾渣2加入到ph值為6.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液中，常溫下混合均勻，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分萃取2h后過濾的濾液3和濾渣3；將濾渣3加入到ph值為8.2的氨水-氯化銨緩沖溶液中，常溫下混合均勻，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分萃取2h后過濾的濾液4和濾渣4。

將濾液1-4合并，用有乙醇萃取，靜置，分層后，取上層水相，重復(fù)上述操作3次；將上述步驟得到的水相溶液加入到膜分離設(shè)備中再次進行分離提純，優(yōu)選截取分子量≤1000da的超濾膜，調(diào)節(jié)膜分離操作溫度為30℃、操作壓力為0.3mpa-0.5mpa；將截留溶液轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)濃縮設(shè)備，攪勻，靜置，過濾，并低溫濃縮成苦楝素濃溶液。

實施例3

將苦楝皮洗凈、烘干，粉碎至100-200目，加水混合，苦楝粉末與水的質(zhì)量比為1:100；充分混合后，加入纖維素酶和果膠酶，纖維素酶和果膠酶和苦楝粉末的質(zhì)量比為1:1:10，調(diào)節(jié)混合體系調(diào)節(jié)ph值為3.5-5.5，溫度為40-50℃，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分反應(yīng)2h后，過濾得到濾液1和濾渣1。

將濾渣1加入到ph值為3.0的醋酸-醋酸銨緩沖溶液中，常溫下混合均勻，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分萃取2h后過濾的濾液2和濾渣2；將濾渣2加入到ph值為6.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液中，常溫下混合均勻，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分萃取2h后過濾的濾液3和濾渣3；將濾渣3加入到ph值為8.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液中，常溫下混合均勻，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分萃取2h后過濾的濾液4和濾渣4。

將濾液1-4合并，用有乙醇萃取，靜置，分層后，取上層水相，重復(fù)上述操作3次；將上述步驟得到的水相溶液加入到膜分離設(shè)備中再次進行分離提純，優(yōu)選截取分子量≤1000da的超濾膜，調(diào)節(jié)膜分離操作溫度為40℃、操作壓力為0.3mpa-0.5mpa；將截留溶液轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)濃縮設(shè)備，攪勻，靜置，過濾，并低溫濃縮成苦楝素濃溶液。

對照例1

本實施例與實施例1的區(qū)別在于不進行膜分離提純。

將苦楝皮洗凈、烘干，粉碎至100-200目，加水混合，苦楝粉末與水的質(zhì)量比為1:50；充分混合后，加入纖維素酶和果膠酶，纖維素酶和果膠酶和苦楝粉末的質(zhì)量比為1:1:20，調(diào)節(jié)混合體系調(diào)節(jié)ph值為3.5-5.5，溫度為40-50℃，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分反應(yīng)2h后，過濾得到濾液1和濾渣1。

將濾渣1加入到ph值為2.2的磷酸氫二鈉-磷酸緩沖溶液中，常溫下混合均勻，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分萃取2h后過濾的濾液2和濾渣2；將濾渣2加入到ph值為5.5的鄰苯二甲酸-氫氧化鈉緩沖溶液中，常溫下混合均勻，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分萃取2h后過濾的濾液3和濾渣3；將濾渣3加入到ph值為8.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液中，常溫下混合均勻，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分萃取2h后過濾的濾液4和濾渣4。

將濾液1-4合并，用乙醇萃取，靜置，分層后，取上層水相，重復(fù)上述操作3次；將上述步驟得到的水相溶液轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)濃縮設(shè)備，攪勻，靜置，過濾，并低溫濃縮成苦楝素濃溶液。

對照例2

本實施例與實施例1的區(qū)別在于不利用半仿生技術(shù)進行提取。

將苦楝皮洗凈、烘干，粉碎至100-200目，加水混合，苦楝粉末與水的質(zhì)量比為1:50；充分混合后，加入纖維素酶和果膠酶，纖維素酶和果膠酶和苦楝粉末的質(zhì)量比為1:1:20，調(diào)節(jié)混合體系調(diào)節(jié)ph值為3.5-5.5，溫度為40-50℃，在超聲功率為200w、超聲頻率為20khz的超聲場中充分反應(yīng)2h后，過濾得到濾液1和濾渣1。

將濾液1用乙醇萃取，靜置，分層后，取上層水相，重復(fù)上述操作3次；將上述步驟得到的水相溶液加入到膜分離設(shè)備中再次進行分離提純，優(yōu)選截取分子量≤1000da的超濾膜，調(diào)節(jié)膜分離操作溫度為20℃、操作壓力為0.3mpa-0.5mpa；將截留溶液轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)濃縮設(shè)備，攪勻，靜置，過濾，并低溫濃縮成苦楝素濃溶液。

本發(fā)明采用繪制特定濃度下苦楝素溶液的標準曲線的方法，通過測量未知濃度苦楝素溶液的吸光度值來檢測最終提取產(chǎn)物的濃度，具體數(shù)據(jù)如下表所示。

從上表測試的結(jié)果可以看出，在其他條件都相同的情況下，通過半仿生法提取得到的苦楝素溶液中苦楝素的濃度更高，原因是在模擬苦楝素在動物體腸胃中存在的條件提取過程得到的苦楝素溶液更加容易穩(wěn)定存在，有效成分含量更多。同時上述結(jié)果表明，通過膜分離技術(shù)可以進一步提升苦楝素的濃度，通過大分子膜的過濾截留作用可以除去多余的雜質(zhì)，因此能夠與生物體作用的苦楝素有效成分的濃度會更高。