間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)中最受關(guān)注的細(xì)胞類型之一。

數(shù)千項(xiàng)使用間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成，許多其他試驗(yàn)仍在研究中。

對(duì)于大多數(shù)治療應(yīng)用，MSC都需要體外培養(yǎng)。然而，體外培養(yǎng)條件并不完全等同在生物體內(nèi)環(huán)境，也就有可能影響到MSCs的生物學(xué)特性，包括它們的再生能力、免疫調(diào)控能力等等。

接下來(lái)我們就一起來(lái)關(guān)注下這些有可能導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞不良事件和功能改變的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

介紹

大多數(shù)科學(xué)報(bào)告展示了細(xì)胞療法的積極方面，但是沒(méi)有介紹可能影響最終產(chǎn)品質(zhì)量的不良事件。

然而，重要的是，MSC是具有不同再生特性的異質(zhì)細(xì)胞群，這些不同的特性可能影響干細(xì)胞治療的最終結(jié)果。

很重要的一個(gè)就是MSC的來(lái)源和供體的年齡。眾所周知，與年輕人和健康人相比，從老年或患病患者中獲得的MSCs群體是不同的。

同時(shí)由于組織中很少存在間充質(zhì)干細(xì)胞，體外總是需要培養(yǎng)來(lái)獲得足夠的細(xì)胞數(shù)從而實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用。在體外培養(yǎng)中，多種非生理?xiàng)l件的影響如氧水平、細(xì)胞密度、培養(yǎng)基含量、傳代次數(shù)和增殖衰老，它們一起改變了MSC的方方面面。

MSC在體外培養(yǎng)期間不良事件潛在風(fēng)險(xiǎn)計(jì)劃

間充質(zhì)干細(xì)胞的多樣性

學(xué)界認(rèn)為，MSC多能性不是細(xì)胞治療的關(guān)鍵方面，旁分泌功能是其組織修復(fù)的主要路徑。然而不同來(lái)源的MSC，其細(xì)胞的外泌體可能不同。

多項(xiàng)研究表明，分離自患病患者的間充質(zhì)干細(xì)胞可能會(huì)釋放出對(duì)再生過(guò)程產(chǎn)生負(fù)面影響的因子。

間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用已經(jīng)實(shí)施很多年。

在以往的臨床試驗(yàn)（特別是西方國(guó)家）中，骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞是最常用的細(xì)胞類型，但是由于骨髓組織的抽吸是一個(gè)痛苦的有創(chuàng)過(guò)程，研究人員一直尋求MSCs的替代來(lái)源。

近年來(lái)，研究表明，與成人來(lái)源相比，新生兒組織具有生物學(xué)優(yōu)勢(shì)，這使得它們成為間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)質(zhì)來(lái)源，新生兒間充質(zhì)干細(xì)胞比間充質(zhì)干細(xì)胞具有更好的增殖能力、更長(zhǎng)的壽命和更有效的分化潛能。

然而尚未得到答案的是，是從不同來(lái)源獲得的MSCs是否代表不同的群體，是否每一種都具有不同的治療應(yīng)用潛力。

MSC體外擴(kuò)增期間的潛在風(fēng)險(xiǎn)影響治療特性

3D細(xì)胞培養(yǎng)

• 體外培養(yǎng)條件

雖然MSCs幾乎存在于所有組織中，但它們?cè)诮M織中的含量相對(duì)較低，大多數(shù)臨床方案推薦單次2000萬(wàn)到1億細(xì)胞量的治療。因此，為了獲得如此高數(shù)量的細(xì)胞，必須進(jìn)行體外擴(kuò)增。

MSC分離方案依賴于這些細(xì)胞粘附到塑料表面的能力，然而，貼壁培養(yǎng)法產(chǎn)生了具有大量祖細(xì)胞和其他細(xì)胞類型的異質(zhì)干細(xì)胞群。另一種方法是使用機(jī)械外植法或用膠原酶進(jìn)行蛋白水解酶處理來(lái)分離MSCs，不過(guò)這可能會(huì)影響細(xì)胞的生物學(xué)特性。

最近報(bào)道，氧水平也是干細(xì)胞生物學(xué)中的一個(gè)關(guān)鍵因素。間充質(zhì)干細(xì)胞以往的體外培養(yǎng)是處于標(biāo)準(zhǔn)氧濃度(21%)下，研究證實(shí)在低氧濃度下培養(yǎng)MSCs可顯著增加細(xì)胞壽命，限制了氧化應(yīng)激、DNA損傷、端粒縮短和染色體畸變。

另一個(gè)應(yīng)該考慮的方面是培養(yǎng)試劑，包括蛋白水解酶、培養(yǎng)基和儲(chǔ)存試劑對(duì)擴(kuò)增的MSCs生物學(xué)特性的影響。培養(yǎng)基中的胎牛血清是有問(wèn)題的，因?yàn)檠逯写嬖诘某煞趾蜕L(zhǎng)因子沒(méi)有被很好地表征，用于MSC體外擴(kuò)增的理想培養(yǎng)基應(yīng)該包含根據(jù)細(xì)胞類型確定的標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)物。

另外，在大多數(shù)情況下，擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞需要冷凍保存，但是保存條件會(huì)改變產(chǎn)品的質(zhì)量。冷凍保存也可以帶來(lái)許多不良事件，譬如改變MSC表型和細(xì)胞功能。最佳的冷凍和解凍溫度控制、冷凍保存介質(zhì)和在液氮中的長(zhǎng)期儲(chǔ)存是應(yīng)該考慮的主要關(guān)鍵因素。

由DMSO組成的冷凍介質(zhì)，盡管對(duì)許多類型的細(xì)胞有毒性，仍然是最常用的冷凍保存溶液。由于DMSO的毒性，通常需要在移植前進(jìn)行洗脫。有報(bào)道顯示，在輸注預(yù)先冷凍在DMSO中的MSCs后，患者出現(xiàn)短暫的并發(fā)癥，包括頭痛、嘔吐和高血壓或低血壓，其中一些人出現(xiàn)了呼吸和心血管問(wèn)題。羥乙基淀粉(HES)可能是細(xì)胞冷凍保護(hù)中DMSO的替代物，然而還需要更多研究。

• 間充質(zhì)干細(xì)胞增殖受損

培養(yǎng)的MSCs在體外通常具有高增殖特性。

然而，細(xì)胞增殖速率取決于許多因素，即MSCs的來(lái)源、細(xì)胞所處階段或培養(yǎng)條件。

已有研究表明，與成人來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，新生兒間充質(zhì)干細(xì)胞具有更高的增殖潛力。

同樣地，培養(yǎng)條件可以改變MSC的增殖，細(xì)胞接種密度可能對(duì)MSC生長(zhǎng)有影響。Mareschi及其同事評(píng)估了初始細(xì)胞密度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)BM-MSCs形態(tài)學(xué)、代謝活性和分化潛能的影響，他們發(fā)現(xiàn)最佳細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)生在較低的初始培養(yǎng)密度，當(dāng)高細(xì)胞接種密度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致扁平細(xì)胞數(shù)量增加和細(xì)胞低增殖率。

與傳統(tǒng)的二維(2D)培養(yǎng)相比，MSC在三維(3D)結(jié)構(gòu)中的培養(yǎng)可以增加其治療潛力。然而，3D培養(yǎng)的細(xì)胞聚集體可以達(dá)到很大的尺寸，如果將這種濃縮細(xì)胞池注射到組織中可能帶來(lái)不良反應(yīng)，譬如肺栓塞或心腦血管梗塞等。此外，3D體中的所有細(xì)胞并非都處于相同的分化階段。

就臨床移植而言，去除動(dòng)物成分的培養(yǎng)基是非常重要的，動(dòng)物成分即具有病毒傳播以及移植受體免疫系統(tǒng)激活的潛在風(fēng)險(xiǎn)的牛血清，自體或同種異體來(lái)源的血漿或血小板裂解物代表了比FBS更安全的替代品。Smith團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了添加了不同濃度hPL的臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)的GMP擴(kuò)增方案。他們觀察到在富含10%富血小板血漿(PRP)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞具有最有效的增殖率。不過(guò)需要注意的是，研究表明從老年患者獲得的自體血漿降低了MSC的增殖特性。

• 間充質(zhì)干細(xì)胞分化不確定

MSC未解決的分化問(wèn)題可以分為兩個(gè)負(fù)面影響。一方面，存在MSC不受控制地分化成不想要的細(xì)胞的問(wèn)題，另一方面，存在完全喪失分化潛能的問(wèn)題。

這個(gè)問(wèn)題可能是由未指定的培養(yǎng)條件引起的，也可能是由于多能間充質(zhì)干細(xì)胞可能因干細(xì)胞生態(tài)位的不同引發(fā)。

一些報(bào)告指出了關(guān)于移植后MSCs自發(fā)分化成未預(yù)知的細(xì)胞類型。譬如在小鼠心肌病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭凶C明了間充質(zhì)干細(xì)胞移植到心臟中導(dǎo)致鈣化，在高脂血癥大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞移植后的腹主動(dòng)脈損傷部位也觀察到了鈣化現(xiàn)象。它提示醫(yī)學(xué)界，在骨組織以外的組織中注射MSC后可能會(huì)發(fā)生骨化過(guò)程。

間充質(zhì)干細(xì)胞衰老與轉(zhuǎn)化的潛在風(fēng)險(xiǎn)

與其他類型的細(xì)胞類似，間充質(zhì)干細(xì)胞存在一定代次的細(xì)胞傳代后衰老的情況。

許多論文已經(jīng)證明，MSCs的長(zhǎng)期擴(kuò)增可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，這與生長(zhǎng)停滯和細(xì)胞凋亡以及其“醫(yī)學(xué)”特性的降低有關(guān)。

Ko及其同事已經(jīng)表明，類似于原代組織細(xì)胞，臍帶血來(lái)源的MSCs (UCB-MSCs)在50次群體倍增(PDs)后啟動(dòng)細(xì)胞分裂的永久停滯。

MSC衰老的過(guò)程也取決于MSCs的不同來(lái)源，有研究顯示AT-MSCs在第七次群體倍增時(shí)出現(xiàn)衰老表型，其特征是細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，細(xì)胞凋亡增加。

間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老與其功能衰退密切相關(guān)。這一過(guò)程的特征包括在培養(yǎng)中觀察到的表型改變，以及形態(tài)學(xué)改變、端粒長(zhǎng)度減少和MSCs免疫特性降低等等。

另外細(xì)胞衰老的另一個(gè)潛在風(fēng)險(xiǎn)是可能的致畸能力，這可能來(lái)自高度增殖細(xì)胞中隨機(jī)突變的積累。米烏拉及其同事已經(jīng)表明，鼠間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)后，獲得了無(wú)限的細(xì)胞增殖潛能，并經(jīng)歷了惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致靜脈注射細(xì)胞后在多個(gè)器官中觀察到纖維肉瘤的形成。在長(zhǎng)期培養(yǎng)中產(chǎn)生的這種轉(zhuǎn)化的MSCs表現(xiàn)出累積的染色體異常、增加的端粒酶活性和c-myc表達(dá)以及對(duì)抗癌藥物更有效的抗性。

這些重要的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了最大限度地減少和限制體外細(xì)胞操作和培養(yǎng)的公知原理。

間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記程序可能會(huì)影響其功能

使用外源性MSCs的臨床應(yīng)用的一個(gè)重要問(wèn)題是了解移植細(xì)胞在受體組織中的命運(yùn)。

由于這個(gè)原因，細(xì)胞標(biāo)記有助于確定在預(yù)期作用位置移植細(xì)胞的狀態(tài)。

適當(dāng)?shù)募?xì)胞染色使得能夠研究外源性細(xì)胞的遷移途徑及其在受體生物體中的持久性，并允許可視化細(xì)胞分化和監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞與宿主組織的整合過(guò)程或消除過(guò)程。

不幸的是，大部分用于外源細(xì)胞標(biāo)記的方法對(duì)干細(xì)胞并不友好。

標(biāo)記MSCs的氧化鐵(SPIO)小顆?？赡軗p害細(xì)胞生物學(xué)的幾個(gè)方面，即遷移特性和集落形成能力。

在熒光標(biāo)記領(lǐng)域，細(xì)胞標(biāo)記對(duì)MSC生物學(xué)的負(fù)面影響的例子更多。Gallina及其同事報(bào)道，在熒光二氧化硅納米顆粒(SiO2-NP) MSC標(biāo)記后，納米顆粒在溶酶體中積累，與未標(biāo)記的細(xì)胞相比，其數(shù)量顯著增加。帶有熒光蛋白編碼基因的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)也可能損害MSC的天然能力，紀(jì)等報(bào)道GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)的MSCs集落形成率低，增殖率不穩(wěn)定。

在其他研究中，在攜帶GFP的MSCs中，MMP-2基因表達(dá)增加，這表明攜帶GFP的MSCs顯示出遷移能力的改變。其他類型的熒光染料，即熒光親脂性陽(yáng)離子吲哚碳菁染料(DiI)或溴脫氧尿苷(BrdU)，明顯導(dǎo)致細(xì)胞活力降低。

也有一些證據(jù)表明，放射性標(biāo)記擾亂了間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖率。氟脫氧葡萄糖-18F處理后不久，間充質(zhì)干細(xì)胞增殖速度減慢。

結(jié)論

在過(guò)去的幾年里，干細(xì)胞移植作為不同疾病的治療手段已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。然而，人們必須意識(shí)到，盡管在治療方法中具有巨大的應(yīng)用潛力，但間充質(zhì)干細(xì)胞也顯示出許多局限性。

本文列舉了部分與MSC療法相關(guān)的潛在問(wèn)題和障礙，包括與制造過(guò)程和細(xì)胞生物學(xué)特性相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。

最令人困擾的問(wèn)題是分離和擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的方案在實(shí)驗(yàn)室之間差異很大，這可能會(huì)顯著影響干細(xì)胞治療的有效性。

因此，制定MSC產(chǎn)品的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)至關(guān)重要，這些產(chǎn)品應(yīng)按照良好醫(yī)療規(guī)范(GMP)加工，具有成本效益，臨床實(shí)用性。只有到那時(shí)，干細(xì)胞療法才會(huì)成為一種成熟的、被廣泛采用的治療方法。

參考資料：Drela K, Stanaszek L, Nowakowski A, Kuczynska Z, Lukomska B. Experimental Strategies of Mesenchymal Stem Cell Propagation: Adverse Events and Potential Risk of Functional Changes. Stem Cells Int. 2019;2019:7012692. Published 2019 Mar 6. doi:10.1155/2019/7012692

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