質(zhì)粒系列之再談無縫連接

e1fcr38dy5cn9y 2023-04-02 發(fā)布于湖北

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我們用兩篇文章的篇幅大概講了一遍質(zhì)粒骨架及其各個要素的介紹：
解剖式學(xué)習(xí)一個質(zhì)粒結(jié)構(gòu)--update
質(zhì)粒系列之什么是質(zhì)粒
再談了最傳統(tǒng)的限制性克隆：
質(zhì)粒系列之限制性克隆--restriction cloning
前面還夾雜的講過一些piggybac、gateway、RMCE的一些內(nèi)容：
基因編輯如何換藥不換湯
慢病毒系列也有講過兩篇：
團隊作案HEK293，史上最強搬磚細胞
 不想再用慢病毒了，我還有什么別的選擇嗎？piggyBac transposon
此外我們本還有一個CRISPR screening的專題，只有開頭，未得完善：精準大海撈針--5. CRISPR screening專題

每次都想要一篇文章的篇幅講完，但知識總是越學(xué)越知道自己的無知，于是每次就像打補丁一樣這里打一下那里打一下，導(dǎo)致文章都不成系列，十分松散。關(guān)于Gibson assembly其實我之前也講過，只是都不記得放在哪一篇里了。這是最近學(xué)習(xí)的筆記。

限制性克隆所謂成也限制性，敗也限制性，限制性克隆的最大的限制來源于其“限制性。Gibson assembly不依賴限制性內(nèi)切酶，可一步完成多個DNA序列的組裝，大大提升DNA組裝速率，同時還可降低載體自連的概率，是多片段DNA序列連接的首選方式。下表簡單比較兩種方法的特點。

	限制性克隆	Gibson assembly
實驗原理	酶切連接	同源重組
工具酶	限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶；必要時需去磷酸化及磷酸化	核酸外切酶（5' or 3'）、DNA聚合酶、DNA連接酶
酶切位點	需特異性酶切位點	不依賴特異性酶切位點
末端	插入片段與載體粘性末端需互補，平端可直連，但平端更易自連。	任意末端都可經(jīng)由PCR加入overlap序列，達到有“同源”可重組的效果。
優(yōu)點	1. 單次實驗花費較低，設(shè)計簡單；2. 分步進行，易于查錯；3. 適用于簡單的片段插入，以及中等大小片段擴增無法達成或易出錯時。	1. 效率高，操作簡單，一步到位；2. 不依賴酶切位點，適用于任意片段。
缺點和隱患	1. 依賴特異性酶切位點，需多步進行，操作復(fù)雜，耗時較長；2. 需備多種限制性內(nèi)切酶，酶存放時間過久易失活；3. 大片段（> 6 kb）連接效率不高。	1. 需要設(shè)計引物并通過高保真PCR擴增片段，片段過長不易擴增且易出錯；2. 同源重組效率依賴于同源臂的選擇，載體內(nèi)有相似序列會影響同源重組效率，也有錯配可能。

1. 一覽眾山小

這查資料的時候發(fā)現(xiàn)特別有趣，原來無論是限制性克隆還是Gibson assembly，都是出自同一個實驗室/機構(gòu)。

image

左邊這位Hamilton Smith教授是II類限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)者之一，并因這一發(fā)現(xiàn)與Daniel Nathans和Werner Arber共同獲得了1978年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。而右邊的Daniel Gibson 于2004年到 J. Craig Venter Institute(克雷格·文特爾研究所 )的 Hamilton Smith組做博后，負責細菌基因組合成的相關(guān)課題。而 J. Craig Venter則因其牽頭人類基因組計劃而聞名，創(chuàng)立了 J. Craig Venter Institute及Synthetic Genomics Inc. (SGI) 公司

2. 發(fā)現(xiàn)之初

從2004年Gibson入職到2008年，不到4年時間，Gibson和Smith在Science上共同發(fā)表了酵母細胞完成支原體基因組組裝的文章，而這篇文章用到的DNA片段組裝方法則在2009年發(fā)表于Nature Methods

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從上圖Nature Methods文章的摘要可看到，Gibson使用5'核酸外切酶，DNA聚合酶和DNA連接酶完成了多DNA片段的一步連接，而這就是我們現(xiàn)在常用的Gibson assembly。

3. 實驗過程示意

一般實驗室都直接購買配好的Gibson assembly mixture，但也可自行購買T5 核酸外切酶、DNA聚合酶以及DNA連接酶配置。Gibson操作簡單，具體過程和步驟都寫在下圖中：

schematic graph

需要注意的事項有：

(1) 一般說明書推薦所有片段都用PCR手段獲得，但長片段會有因PCR而引入突變，因此，骨架大片段可采用限制性內(nèi)切酶處理后獲取。

(2) 如果兩端序列中有多個同源序列，則會有錯誤同源重組的可能，例如Loxp序列等等。

4. 核酸內(nèi)切酶 vs 核酸外切酶

對比限制性克隆和Gibson assembly，最大的區(qū)別是無需特定的酶切位點，然而實際上還是需要overlap的懸端，只是這個懸端可以由PCR帶來，同時核酸外切酶的末端修整，使得overlap序列暴露，從而完成同源重組。那么核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶的差別和分類我們可以簡單來學(xué)習(xí)一下：

Endo & exo

從名字來看，內(nèi)切酶切的是序列內(nèi)部，外切酶切的則為外部（5’或3'末端），具體的比較可如下表：

Basis for Comparison	Endonuclease	Exonuclease
定義	切割多核苷酸內(nèi)部磷酸二酯鍵的酶類	可以一次從5 '或3 '端切割多核苷酸鏈中的DNA序列的酶類
分類	3類：I型和III型是大型多亞基復(fù)合物，包括內(nèi)切酶和甲基化酶活性； I型可以切割距離識別序列大約1000個堿基對或更遠的位點，它需要ATP作為能量來源；III型則可可識別短的不對稱序列，切割距離識別序列外約25個堿基對的位點，在這個過程中也需要ATP ；而II型則由Hamilton發(fā)現(xiàn)，它們是內(nèi)切酶的簡單版本，通常識別短回文序列并直接切割該序列，在降解過程中不需要ATP	真核生物和原核生物有三種類型的外切酶參與mRNA的正常轉(zhuǎn)換: （I型）5’ - 3'外切酶 (Xrn1)，這是一個依賴的脫殼蛋白; （II型）非依賴性 3′ - 5′ 核酸外切酶；（III型）poly(A)特異性3’ - 5'外切酶。
活性遲滯期	由于某些核酸內(nèi)切酶是限制性內(nèi)切酶，因此在該酶類識別到特定位點之前，該酶不具活性，此為活性遲滯期。	無
切割結(jié)果	由于切割的是序列內(nèi)部，因此產(chǎn)物也是多核苷酸	裂解DNA序列，產(chǎn)生單個核苷酸或核苷
末端	可以是平端或粘性末端	粘性末端
特異性	限制性內(nèi)切酶可用于切割DNA序列中的特定位點。	一般無特異性
防御屬性	部分可防御外來病原體	并無防御外來病原體的屬性
對環(huán)狀DNA的效果	可切割	對環(huán)狀DNA的活性低于現(xiàn)狀DNA
可抑制性	內(nèi)切酶硫代磷酸酯鍵連接的核苷酸仍具有活性，除非整個序列都是這個鍵。	對硫代磷酸酯連接的核苷酸不具活性

結(jié)語

兩種方法自是各有優(yōu)缺，雖目前多用Gibson assembly，但限制性克隆仍然常用。限制性內(nèi)切酶種類繁多，其中Type IIS克隆更是被稱為Golden Gate cloning。從操作時間來看，Golden Gate是最簡單的方法之一，單管內(nèi)酶切和連接可在30分鐘內(nèi)完成。由于Type IIS酶切不保留酶的識別位點，因此連接產(chǎn)物的形成是不可逆的，連接效率幾近100%。且Golden Gate 克隆限制性克隆需分步完成的缺點，在同一管內(nèi)可完成多達10個片段的連接，果子老師稱之為--質(zhì)粒改造的王者。下周，我們將會聊聊這Golden Gate cloning，敬請期待。