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▉ 導(dǎo)語
 本綜述描述了熒光2、1、3-苯并噻二唑(BTD)衍生物，自首次被用于生物成像實(shí)驗(yàn)以來，近十年時(shí)間的使用進(jìn)展。該綜述描述了含BTD的熒光團(tuán)的使用，特別是用于成像細(xì)胞核、線粒體、脂滴、傳感器、蛋白質(zhì)和相關(guān)事件的標(biāo)記物、生物過程和活性、溶酶體、質(zhì)膜、多細(xì)胞模型和動(dòng)物。還描述了常見于BTD熒光結(jié)構(gòu)的一些物理化學(xué)和光物理特性。
BTDs優(yōu)先以醌類形式存在（方案1)，盡管芳香族和兩性離子芳香族(葉立德）形式也有助于它們的光物理性質(zhì)。這些內(nèi)消旋的形式在能量上并不相等，因此干擾了結(jié)構(gòu)的帶隙能量。BTDs的電性能和光性能可能受到這些形式的影響。BTD熒光染料的發(fā)射波長表明了實(shí)際效果，而BTD熒光染料又可以作為生物成像探針應(yīng)用于整個(gè)可見光譜中。電子受體醌類結(jié)構(gòu)通常用于減少帶隙能量，如在小帶隙聚合物中觀察到的那些。醌類形式的主導(dǎo)降低了LUMO（最低未占據(jù)的分子軌道）能量，從而使其能量更接近HOMO（最高占據(jù)的分子軌道）。根據(jù)所使用的取代基，BTD衍生物的帶隙能量和發(fā)射顏色可以進(jìn)行調(diào)整。BTD核心的強(qiáng)電子接受特性通常用于設(shè)計(jì)和合成D-π-A結(jié)構(gòu)。D-A結(jié)構(gòu)中的π間隔區(qū)對(duì)π-偶聯(lián)有影響，因此也影響熒光BTD的光特性，但原則上，它對(duì)穩(wěn)定來自激發(fā)態(tài)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)并不是必要的。ICT通常從供體部分到BTD核心（方案1）。BTD的核心是一個(gè)極性雜環(huán)。激發(fā)后，BTD衍生物通常顯示出極性ICT傾向的激發(fā)態(tài)。優(yōu)先的正醌類BTD核及其永久電偶極矩能夠影響B(tài)TDs的溶解度、結(jié)晶度、載流子遷移率以及后續(xù)的光物理性質(zhì)。BTD核心的疏水特征通常通過在結(jié)構(gòu)的4,7位進(jìn)行π-擴(kuò)展(如Ph，C=C或C≡C基團(tuán))來改善。BTD核心被描述為疏水結(jié)構(gòu)并不罕見。
方案1 （上）BTD雜環(huán)的內(nèi)消旋形式突出了醌類形式（主要貢獻(xiàn)）。（下）顯示了一個(gè)具有一般供體基團(tuán)的非特異性熒光BTD衍生物（綠色），其可信的ICT過程（黑色）和BTD核心的強(qiáng)電子受體特性（紅色）。 BTD衍生物的一些具有吸引力的特征如下： 1. 一般來說，π-擴(kuò)展的BTD結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，當(dāng)這些熒光團(tuán)發(fā)光時(shí)，沒有注意到降解 2. BTD核心的缺電子特性對(duì)于規(guī)劃具有高效穩(wěn)定過程的新穩(wěn)定結(jié)構(gòu)具有重要意義 3. BTD衍生物通常表現(xiàn)出良好到優(yōu)良的熱穩(wěn)定性 4. 熒光BTD衍生物通常顯示出較大的Stokes位移，從而避免了不希望的背景干擾，并通過使用適當(dāng)?shù)臑V波片有效地阻止激發(fā)光到達(dá)探測(cè)器 5. 較長的照射時(shí)間通常是可能的，而不會(huì)褪色 6. 明亮的發(fā)射，沒有明顯的肉眼閃爍 7. 在生物成像實(shí)驗(yàn)中，通?？梢垣@得良好到優(yōu)秀的信噪比 8. 大多數(shù)描述的熒光小有機(jī)BTD被證明能夠轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞膜，只有少數(shù)例外, 用于選擇性染色質(zhì)膜的BTDs沒有穿過質(zhì)膜，但與該細(xì)胞器表現(xiàn)出很強(qiáng)的相互作用，這將在本文中討論 9. 大多數(shù)熒光btd可以在400nm以上（可見光區(qū)域）被激發(fā)。因此，可以避免細(xì)胞自身熒光，激光強(qiáng)度較低，可以避免溫度升高，不引起氧化應(yīng)激，可以防止形態(tài)學(xué)改變，有利于獲得高質(zhì)量的圖像。 10. 衍生物的親脂性可以通過適當(dāng)選擇取代基來調(diào)整，從而幫助將結(jié)構(gòu)引導(dǎo)到特定的細(xì)胞區(qū)域或特定的生物反應(yīng)。 11. 理論計(jì)算可能非常有用，并有助于預(yù)測(cè)在其他地方演示的光特性 12. 一般來說，通常在室溫下，BTD可以作為純固體或溶液存儲(chǔ)，并準(zhǔn)備用于生物成像實(shí)驗(yàn)。大多數(shù)市售的試劑盒需要存儲(chǔ)在-20到-80°C之間，并且容易被自由凍融循環(huán)降解。 在BTD核心的4,7-位上包含的已知染料的結(jié)構(gòu)能夠進(jìn)行ESIPT（激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移)，因此直接影響最終框架的光物理性質(zhì)(圖2）。兩種BTD衍生物對(duì)dsDNA的親和力在使用這些染料選擇性染色的生物實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。與已知的能染色細(xì)胞核的市售DAPI相比，使用所開發(fā)的熒光團(tuán)可以觀察到更好的結(jié)果。BI和BT在細(xì)胞中具有較低的水溶性和沉淀性，而BTD熒光團(tuán)(BTD-BT和BTD-BI)具有較高的水溶性，從而允許在細(xì)胞核中進(jìn)行高效的dsDNA染色。
圖2。（左）熒光設(shè)計(jì)的BTDs作為活細(xì)胞熒光成像探針，用于染色人類干細(xì)胞細(xì)胞核中的dsDNA（右）。 一些BTDs已經(jīng)在生物成像實(shí)驗(yàn)測(cè)試為所謂的最小選擇性，也就是說，這些熒光染料可以分散在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，但沒有穿過核膜，因此觀察到細(xì)胞核，但沒有任何偏好特定的細(xì)胞器的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域（圖3）。其他一些BTDs已被證明能夠以非特異性方式對(duì)整個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜和核膜進(jìn)行染色（圖3）。然而，在這兩種情況下，生物成像的應(yīng)用都是相當(dāng)有限的。
圖3 熒光BTD衍生物與最小的選擇和非特異性染色 作為真核細(xì)胞的DNA攜帶細(xì)胞器，線粒體大小為0.5~1.0μm（直徑）。線粒體(≈-180mV)的負(fù)膜電位在其脂質(zhì)雙分子層中不斷保持。離子通道泵和氧化通道輔助細(xì)胞器來維持這種非常負(fù)的電位。圖4顯示了已經(jīng)描述的用于選擇性染色線粒體的熒光BTD衍生物的結(jié)構(gòu)。
圖4 熒光BTD衍生物用于線粒體選擇性染色  LDs主要由膽固醇、甾醇酯和甘油三酯中性脂質(zhì)核組成。這個(gè)核心被一個(gè)包含多個(gè)關(guān)聯(lián)蛋白的磷脂單層殼所覆蓋。當(dāng)中性脂質(zhì)在細(xì)胞中達(dá)到臨界水平后，它們組裝成脂滴結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)能量?jī)?chǔ)存。BTD核心的熒光探針（圖5）已有一些用于靶向脂滴。
圖5 用于選擇性染色LDs的熒光BTD衍生物 熒光BTD衍生物也被用作幾種分析物的傳感器（圖6），盡管與經(jīng)典的支架基熒光團(tuán)相比，它開始的時(shí)間較晚。
圖6 熒光BTD衍生物被用作細(xì)胞內(nèi)幾種分析物的傳感器 使用基于BTD的生物探針（圖7）來可視化和監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)是最近出現(xiàn)的。
圖7 用于蛋白質(zhì)可視化的熒光BTD衍生物及其相關(guān)過程 熒光BTD衍生物也被應(yīng)用作熒光生物探針來監(jiān)測(cè)不同分子的不同過程和活性（圖8）。
圖8 用于監(jiān)測(cè)生物過程和活動(dòng)的熒光技術(shù) 蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物和脂質(zhì)是溶酶體中通常降解的生物分子?？紤]到內(nèi)吞途徑，溶酶體是末端隔室。在溶酶體中發(fā)現(xiàn)了許多不同類型的水解酶，如脂肪酶、核酸酶、糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、磷酸酶和硫酸鹽酶。所有這些酶在酸性條件下通常具有最大的催化活性，因此溶酶體的平均pH值在4.5到5.5之間。雖然大量的熒光染料用于可視化溶酶體及其細(xì)胞事件，但到目前為止，只有四種熒光BTD衍生物（圖9）被描述為選擇性生物成像探針來染色這個(gè)特定的細(xì)胞器，它們都是最近發(fā)表的。
圖8 熒光BTD衍生物具有選擇性的溶酶體染色 雖然PM的重要性，但直到最近，基于BTD的生物探針才被專門報(bào)道為選擇性熒光細(xì)胞成像探針（圖9）。
圖9 熒光BTD衍生物可選擇性地進(jìn)行質(zhì)膜染色 一些類似于BTD成功應(yīng)用于熒光生物成像探針的結(jié)構(gòu)如圖10所示。
圖10 熒光結(jié)構(gòu)與BTD雜環(huán)相似
▉ 小結(jié) 本文回顧了熒光BTD作為生物成像探針的應(yīng)用的巨大發(fā)展。自2010年首次發(fā)表以來，一些細(xì)胞器、細(xì)胞過程、多細(xì)胞模型和動(dòng)物目前被熒光BTD衍生物染色。 參考文獻(xiàn)： Neto, B. A. D.; Correa, J. R.; Spencer, J., Fluorescent Benzothiadiazole Derivatives as Fluorescence Imaging Dyes: A Decade of a New Generation Probes. Chemistry 2021. DOI: 10.1002/chem.202103262 |
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