易基因：簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序(RRBS)在植物生態(tài)表觀基因組學(xué)中的機(jī)遇和局限｜深度綜述

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2019年，《New Phytol》雜志發(fā)表了題為“Opportunities and limitations of reduced representation bisulfite sequencing in plant ecological epigenomics”的綜述文章，評(píng)估了簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）在非模式植物物種中的機(jī)遇和局限性。

期刊：New Phytologist

日期：2019.01

IF：10.323 /Q1

摘要

研究表觀遺傳機(jī)制在生物和生態(tài)系統(tǒng)中的特征和影響對(duì)于理解表觀遺傳學(xué)的生態(tài)相關(guān)性非常重要，已開發(fā)多種具有成本效益的簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序（RRBS），并將其應(yīng)用于缺乏良好注釋參考基因組的不同生物。新方法改善了生態(tài)環(huán)境中表觀遺傳多樣性的評(píng)估，并可能提供功能性見解。本綜述評(píng)估了RRBS在非模式植物物種中的機(jī)會(huì)和局限性。經(jīng)過深思熟慮的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，包括互補(bǔ)基因表達(dá)研究和目標(biāo)群體基因組學(xué)資源改善，有望最大限度地發(fā)揮未來(lái)RRBS研究的效果。

一、背景

生態(tài)表觀遺傳學(xué)旨在了解表觀遺傳機(jī)制對(duì)生態(tài)和進(jìn)化過程的獨(dú)特貢獻(xiàn)。一些研究表明，DNA甲基化變化與生態(tài)因素相關(guān)，表明表觀遺傳學(xué)在適應(yīng)中的潛在作用。然而許多非模式生物研究的低基因組分辨率無(wú)法準(zhǔn)確分析表觀遺傳效應(yīng)的因果關(guān)系，甚至在少數(shù)植物和動(dòng)物模式生物的特性重也存在。近期研究討論了如何將高分辨率表觀基因組學(xué)工具與生態(tài)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)置相結(jié)合，以探索表觀遺傳機(jī)制的重要性，為評(píng)估表觀遺傳機(jī)制與生態(tài)和進(jìn)化的相關(guān)性，這些方法需要應(yīng)用于各種生物和條件。然而強(qiáng)大的表觀基因組學(xué)方法在很大程度上只適用于少數(shù)模式物種。全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）是評(píng)估基因組胞嘧啶甲基化狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但這種方法仍然局限于具有高質(zhì)量參考基因組的物種，且WGBS對(duì)于大型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)說(shuō)，尤其是中到大型基因組植物，成本高昂。

簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（RRBS）方法，僅對(duì)基因組重要表觀調(diào)控區(qū)域進(jìn)行深度測(cè)序，為WGBS提供了一種經(jīng)濟(jì)高效的替代方法。RRBS可擴(kuò)展用于生態(tài)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可用于沒有參考基因組的生物，并比以前基于標(biāo)記的方法具有更高分辨率。RRBS reads還可以比對(duì)到參考基因組或參考基因組“草圖”，并可能提供功能性見解。對(duì)于沒有參考基因組的物種，RRBS可以僅為捕獲的位點(diǎn)生成特異性參考，如通過在測(cè)序中非重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的樣本或從亞硫酸鹽處理的reads本身推斷未轉(zhuǎn)化的參考。因其屬性與成本效率相結(jié)合，RRBS方法對(duì)于研究生物的生態(tài)和進(jìn)化表觀遺傳學(xué)更具吸引力。然而，重要的是要評(píng)估這些方法的優(yōu)勢(shì)和局限性，以確定哪些研究問題可以得到有效解決。

二、RRBS位點(diǎn)作為全基因組表觀遺傳標(biāo)記

相比MSAP甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)或MS-AFLP/MAP等早期方法，RRBS技術(shù)可以在全基因組范圍內(nèi)探索DNA甲基化變化模式，在數(shù)萬(wàn)個(gè)片段中的每個(gè)片段中檢測(cè)多個(gè)胞嘧啶位置。與早期方法不同，RRBS數(shù)據(jù)在核苷酸分辨率上是定量的，可以反應(yīng)組織樣本細(xì)胞間DNA甲基化的生物學(xué)特性。RRBS可以分析不同序列環(huán)境（CG、CHG、CHH）中的DNA甲基化信息，這些不同DNA環(huán)境中的甲基化與不同功能相關(guān)，受不同分子通路調(diào)控，已知具有不同遺傳力和環(huán)境敏感性水平，從而為分析DNA甲基化的自然模式提供進(jìn)一步工具。通過對(duì)RRBS數(shù)據(jù)進(jìn)行整合以量化個(gè)體之間DNA甲基化的整體相似性，為描述自然群體內(nèi)或群體間的表觀遺傳變化模式提供基礎(chǔ)。

這種描述性的群體表觀遺傳學(xué)檢測(cè)為表觀遺傳變化水平提供了有用的見解。如自然表觀遺傳種群結(jié)構(gòu)在多大程度上與潛在遺傳種群結(jié)構(gòu)相關(guān)？與環(huán)境變化相關(guān)？在擬南芥自然種群、玉米實(shí)驗(yàn)種群和大豆重組自交系（RIL）的幾項(xiàng)研究中觀察到表觀遺傳和遺傳結(jié)構(gòu)之間的強(qiáng)相關(guān)性，表明表觀遺傳變化很大程度受遺傳調(diào)控。這些研究主要檢測(cè)差異甲基化區(qū)域（DMR）和相鄰遺傳多態(tài)性之間的關(guān)聯(lián)，以表明順式作用對(duì)DNA甲基化的遺傳調(diào)控；同時(shí)還檢測(cè)到反式關(guān)聯(lián)，如CHH甲基化和染色體甲基轉(zhuǎn)移酶CMT2的遺傳變異之間的關(guān)聯(lián)。然而當(dāng)自發(fā)性突變穩(wěn)定遺傳時(shí)，在沒有遺傳調(diào)控的情況下也可能出現(xiàn)順式和反式關(guān)聯(lián)。此外有研究報(bào)道，表觀遺傳群體結(jié)構(gòu)的一個(gè)組分沒有受遺傳結(jié)構(gòu)調(diào)控，而是與生態(tài)條件相關(guān)。這表明表觀遺傳學(xué)可以直接或間接地促進(jìn)適應(yīng)：（1）表觀遺傳變化由環(huán)境條件誘導(dǎo)，并提供表型可塑性或長(zhǎng)期遺傳反應(yīng)力；（2）與整體（平均）遺傳群體結(jié)構(gòu)不相關(guān)的表觀遺傳變化可以受單個(gè)遺傳位點(diǎn)調(diào)控。

除表征自然DNA甲基化變化外，植物中胞嘧啶甲基化的高遺傳力表明RRBS位點(diǎn)可以作遺傳變異有限或缺失的雜交中連接比對(duì)目標(biāo)的標(biāo)記。此外DNA甲基化動(dòng)力學(xué)的一般特征，如跨代穩(wěn)定性、表觀突變和逆轉(zhuǎn)率，以及對(duì)感興趣的實(shí)驗(yàn)或田間條件的響應(yīng)，可以通過觀察基因組中的多個(gè)（不一定是全部）位點(diǎn)來(lái)研究，因此可以利用RRBS方法解決。

三、RRBS位點(diǎn)的功能注釋

RRBS片段中的DNA序列可以顯示DNA甲基化差異基因組區(qū)域功能信息（圖1），尤其是增強(qiáng)子元件的表觀遺傳變化可以驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)改變并產(chǎn)生功能性作用。RRBS最初為哺乳動(dòng)物研究而開發(fā)，其中大部分基因啟動(dòng)子與GC富集區(qū)域（CpG島）相關(guān)，這些區(qū)域的甲基化狀態(tài)對(duì)基因調(diào)控具有功能性影響。使用偏向GC富集位點(diǎn)（如MspI）的限制性內(nèi)切酶，哺乳動(dòng)物中的RRBS通過僅靶向整體基因組的一小部分來(lái)評(píng)估80%-90%的CpG島甲基化水平，而典型的植物基因組缺失CpG島，基于MspI的基因組代表性減少不會(huì)導(dǎo)致對(duì)基因啟動(dòng)子偏倚。然而通過選擇不同的限制性內(nèi)切酶、增加整體基因組代表性，可以在植物中實(shí)現(xiàn)對(duì)基因體或基因啟動(dòng)子區(qū)域的偏倚，如當(dāng)覆蓋率增加到整體基因組約19%時(shí)，使用限制性內(nèi)切酶MseI的RRBS在玉米中捕獲＞80%的注釋基因啟動(dòng)子區(qū)域。使用不同的酶（CviQI）對(duì)15%基因組＞80%的基因體進(jìn)行測(cè)序，基因組功能組分的富集可以對(duì)功能進(jìn)行深入研究，如Hsu等人（2017）鑒定出與特定啟動(dòng)子DNA甲基化譜相關(guān)的組織特異性表達(dá)基因。此外，基于RNA-seq或qPCR的表達(dá)分析可以配合補(bǔ)充RRBS數(shù)據(jù)集，揭示與DNA甲基化變化相關(guān)的基因表達(dá)變化。

圖1：通常生態(tài)表觀遺傳學(xué)研究會(huì)對(duì)與兩種不同環(huán)境條件相關(guān)的甲基化差異感興趣，如圖所示。RRBS數(shù)據(jù)可以提供非模式物種（如最左邊RRBS位點(diǎn)）的功能研究，但在沒有參考基因組的情況下檢測(cè)RRBS片段的基因組背景很困難。單個(gè)RBBS位點(diǎn)的胞嘧啶數(shù)量可能不足以calling差異甲基化區(qū)域（DMR）；因此，RRBS分析傾向calling差異甲基化位點(diǎn)（DMP）。TE，轉(zhuǎn)座元件。

四、 RRBS方法對(duì)非模式物種的局限性

RRBS可以靶向基因組的功能區(qū)域，但非模式物種中RRBS位點(diǎn)的基因組背景鑒定通常僅限于與注釋物種同源性的片段（圖1）。隨著基因及其功能的不斷發(fā)展演變，這種方法可能會(huì)影響對(duì)非模式物種中獲得信息的正確解釋。在沒有參考基因組的情況下，參考轉(zhuǎn)錄組可以幫助改善功能預(yù)測(cè)，但即使大部分RRBS片段與注釋良好的轉(zhuǎn)錄組交集或用已知的植物基因注釋，實(shí)際上只有一些片段與基因的5'末端有交集，其中DNA甲基化增加與基因沉默相關(guān)。植物5'末端之外的基因體甲基化功能相關(guān)性因環(huán)境和分類群而不同，且基因體甲基化通常與基因表達(dá)不相關(guān)或僅呈弱相關(guān)。因此，盡管啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與基因沉默強(qiáng)相關(guān)，但如果沒有目標(biāo)物種或近親注釋良好的參考基因組，則很難甚至不可能鑒定出與啟動(dòng)子區(qū)域交集的RRBS片段。另外中到大型基因組的植物可能沒辦法獲得足夠的基因組覆蓋。

RRBS方法比早期方法更能檢測(cè)異常位點(diǎn)或鑒定高FST位點(diǎn)，表明RRBS可以在生態(tài)重要基因組區(qū)域上進(jìn)行選擇。表觀遺傳信號(hào)的共遺傳可能不太穩(wěn)定且RRBS可能遺漏的一個(gè)或幾個(gè)相鄰基因組元件，相對(duì)較少功能位點(diǎn)調(diào)控的性狀可能在RRBS中被遺漏，這個(gè)問題在基因組大而復(fù)雜的物種中被放大。

RRBS的另一個(gè)難點(diǎn)在于鑒定差異甲基化區(qū)域（DMR）。對(duì)多種物種的研究發(fā)現(xiàn)，與單個(gè)胞嘧啶的差異甲基化位點(diǎn)（differentially methylated positions ，DMP）相比，大染色體片段的DMRs甲基化變化更可能影響附近位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄活性，并導(dǎo)致表型變化。但即使在全基因組甲基化研究中，DMR也難以定義。RRBS捕獲的短片段（<500 bp）僅包含幾個(gè)胞嘧啶位點(diǎn)，且在多數(shù)情況下用這些數(shù)據(jù)calling具有統(tǒng)計(jì)意義的DMR很困難（圖1），因此大多數(shù)RRBS研究更傾向固有隨機(jī)calling DMP。

植物基因組進(jìn)化由多倍體化和雜交形成，它們?cè)谥参锒鄻踊瓦m應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。采用高深度的測(cè)序方法來(lái)鑒定重復(fù)位點(diǎn)的所有拷貝，尤其對(duì)于雜合度高的位點(diǎn)，且會(huì)因?yàn)榈头直媛实亩唐味枰呱疃葴y(cè)序。這意味著在特定位點(diǎn)上分析不同拷貝的多態(tài)性數(shù)量將分級(jí)為基因組中不同位點(diǎn)的多態(tài)性數(shù)量。這一水平的基因組景觀信息雖然僅限于極少數(shù)非模式物種，但對(duì)理解序列水平和甲基化變化對(duì)生態(tài)和進(jìn)化的重要性產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

最后，揭示表觀遺傳變異在不同系統(tǒng)和環(huán)境中受遺傳變異調(diào)控或部分自主的程度仍然是理解表觀遺傳變化的生態(tài)和進(jìn)化作用的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。RRBS數(shù)據(jù)為評(píng)估整體遺傳和表觀遺傳群體結(jié)構(gòu)提供了足夠的信息，從而可以評(píng)估兩者之間的整體相關(guān)性。原則上用全基因組甲基化數(shù)據(jù)比RRBS數(shù)據(jù)能更好地解決這個(gè)問題，但在缺乏全基因組甲基化數(shù)據(jù)的情況下，RRBS在鑒定單個(gè)表觀遺傳變化的遺傳決定因素方面受到限制。

五、最大限度地提高RRBS對(duì)植物的作用

無(wú)論是作為遺傳信號(hào)，還是對(duì)環(huán)境條件或?qū)嶒?yàn)處理的塑性反應(yīng)，RRBS都能檢測(cè)表觀基因組景觀中的變化模式。然而鑒定局部適應(yīng)需要在田間的對(duì)等移植研究或在受控環(huán)境中實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)特定的生物反應(yīng)模式，理想情況下可以調(diào)控所有遺傳影響。仔細(xì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件對(duì)于評(píng)估表觀遺傳變化尤為重要，合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以得到關(guān)于表型可塑性基礎(chǔ)變化的信息來(lái)揭示表觀遺傳機(jī)制，并鑒定與遺傳差異或起源生境相關(guān)的變化。分析至少三代的子代可以更好地評(píng)估標(biāo)記物的跨代遺傳性，但需要仔細(xì)考慮子代的生長(zhǎng)環(huán)境。

RRBS的靈敏度可以通過多種技術(shù)方法來(lái)改善。如限制性內(nèi)切酶的選擇決定了捕獲的基因組區(qū)域，甲基化敏感酶將靶向植物基因組中高甲基化重復(fù)區(qū)域，從而富集到編碼區(qū)域。但這些酶可能會(huì)導(dǎo)致丟失數(shù)據(jù)，尤其在DMR中。GC富集的限制性位點(diǎn)的酶會(huì)向重復(fù)區(qū)域偏倚，因?yàn)閹追N轉(zhuǎn)座元件（TE）與AT富集的基因組區(qū)域相關(guān)。此外，無(wú)論基因組背景如何，限制性內(nèi)切酶（具有更短的識(shí)別序列）可以增加基因組的代表性。此外，RRBS還可以通過利用產(chǎn)生更長(zhǎng)reads的平臺(tái)（如MiSeq）或通過使用配對(duì)末端測(cè)序方法優(yōu)化文庫(kù)以跨更大區(qū)域獲取信息（如Illumina的bsRADseq高達(dá)800bp）來(lái)改進(jìn)，這增加了注釋和calling DMR的可能性，并可能鑒定啟動(dòng)子。

DNA甲基化分析需要一些額外的考慮因素，因?yàn)橹貋喠蛩猁}測(cè)序可能難以區(qū)分取代（substitutions）和表觀等位基因（epialleles）變化。尤其C或G突變?yōu)锳或T可能看起來(lái)是表觀突變，因?yàn)閬喠蛩猁}處理將未甲基化的胞嘧啶脫氨成尿嘧啶，然后尿嘧啶通過PCR擴(kuò)增與胸腺嘧啶配對(duì)，單個(gè)參考基因組提供不了區(qū)分這些可能性所需的信息。由于RRBS與WGBS相比具有成本優(yōu)勢(shì)，即使是用于區(qū)分個(gè)體間遺傳變異與甲基化變化的大型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，也可以對(duì)每個(gè)種質(zhì)的未轉(zhuǎn)化參考進(jìn)行測(cè)序。

六、結(jié)論

在過去幾年中出現(xiàn)了幾種RRBS方法，增加了非模式物種表觀遺傳學(xué)研究的潛力并擴(kuò)大了研究范圍。這些方法提高了基于標(biāo)記方法的分辨率，但它們?cè)跊]有良好參考基因組物種中的功能作用方面還存在局限性（圖1），主要局限于難以將RRBS片段靶向功能最相關(guān)的DNA甲基化環(huán)境——啟動(dòng)子區(qū)域和轉(zhuǎn)錄區(qū)域的5'末端。盡管存在富集特定基因組的方法，但生成參考基因組草圖對(duì)于定位啟動(dòng)子區(qū)域和更好利用RRBS數(shù)據(jù)至關(guān)重要。因此，改善各種生物的基因組學(xué)資源是理解表觀遺傳機(jī)制在生態(tài)和進(jìn)化中的重要作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

關(guān)于易基因植物簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序（Plant-RRBS）

DNA甲基化在植物基因組中以CG、CHG和CHH三種堿基序列的胞嘧啶上發(fā)生（H=A，T或C），甲基化轉(zhuǎn)移酶包括DRM，CMT和MET等。在植物中，DNA胞嘧啶的甲基化會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)的改變和轉(zhuǎn)座因子的失活，修飾狀態(tài)的改變可能產(chǎn)生具有不同表型狀態(tài)的表觀等位基因。

全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）是植物甲基化檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。RRBS在哺乳動(dòng)物甲基化檢測(cè)中廣泛應(yīng)用，但對(duì)植物基因組C堿基甲基化檢測(cè)覆蓋度極為有限。易基因研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建的雙酶切DRRBS（Plant-RRBS）被同行研究證明，對(duì)于大基因組或植物群體基因組甲基化的檢測(cè)極為有效，胞嘧啶覆蓋廣泛。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• 精確度高： 在其覆蓋范圍內(nèi)可達(dá)到單堿基分辨率；

• 重復(fù)性好： 多樣本的覆蓋區(qū)域重復(fù)性可達(dá)到85%-95%，適用于多樣本間的差異分析；

• 性價(jià)比高： 測(cè)序區(qū)域針對(duì)高CpG區(qū)域，數(shù)據(jù)利用率更高；

• 原創(chuàng)技術(shù)： 雙酶切DRRBS原創(chuàng)技術(shù)；發(fā)表BMC genomics；陶謙教授極力推薦。

信息分析：

技術(shù)開發(fā)：

• 背景：
  基于RRBS位點(diǎn)覆蓋缺陷性，研發(fā)更具代表性的簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序技術(shù)。

• 方法：
  通過幾十種不同的限制性內(nèi)切酶模擬評(píng)估，篩選MspI、ApekI和DpnII等酶切組合應(yīng)用于動(dòng)物、植物樣本基因組甲基化檢測(cè)，提高CG、CHG和CHH位點(diǎn)的覆蓋度。

• 結(jié)論：雙酶切RRBS可以顯著提高哺乳動(dòng)物基因組，特別是調(diào)控區(qū)域的CG位點(diǎn)覆蓋度，對(duì)于MRD檢測(cè)更加準(zhǔn)確；Plant-RRBS對(duì)于植物基因組甲基化檢測(cè)而言，與全基因組甲基化檢測(cè)相比，可分析位點(diǎn)相當(dāng)，但是測(cè)序深度更高。

參考文獻(xiàn)：

1. Paun O, et al. Opportunities and limitations of reduced representation bisulfite sequencing in plant ecological epigenomics. New Phytol. 2019 Jan;221(2):738-742.

2. Junwen Wang, et al. Double restriction-enzyme digestion improves the coverage and accuracy of genome-wide CpG methylation profiling by reduced representation bisulfite sequencing, BMC Genomics. 2013 Jan 16;14:11.

3. Martin Schmidt, et al. Plant-RRBS, a bisulfite and next-generation sequencing-based methylome profiling method enriching for coverage of cytosine positions, BMC Plant Biol. 2017 Jul 6;17(1):115.

4. Martin Schmidt, et al. Plant-RRBS: DNA Methylome Profiling Adjusted to Plant Genomes, Utilizing Efficient Endonuclease Combinations, for Multi-Sample Studies, Methods Mol Biol. 2020;2093:65-80.

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