張佳琳  路則府

各位專(zhuān)家老師大家好，我是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥基因資源 與利用團(tuán)隊(duì)的路則府，今天有幸代表“一麥眾承”3號(hào)“麥動(dòng)中原”組值日。我們組長(zhǎng)是河南省農(nóng)科院的曹廷杰老師，組員有李文旭老師、萇收偉老師、張福彥老師、劉保華老師、王書(shū)平老師、孟倩老師、張娜老師、閆文利老師、桑偉老師和我。

首先感謝陳紅敏老師創(chuàng)建“一麥眾承”交流平臺(tái)和公眾號(hào)，陳老師每天準(zhǔn)時(shí)推送文章實(shí)屬令人敬佩。同時(shí)感謝群里各位專(zhuān)家老師分享寶貴的工作經(jīng)驗(yàn)，使我大開(kāi)眼界并受益匪淺，為以后育種工作提供很多新思路。本人一直從事作物的基礎(chǔ)研究，主要研究方向是功能基因組學(xué)和表觀基因組學(xué)。自2020年回國(guó)參加工作，開(kāi)始從事小麥研究，相關(guān)的經(jīng)驗(yàn)還非常有限。在此，針對(duì)我們?cè)跍y(cè)序技術(shù)上的一些理解，討論小麥遺傳背景檢測(cè)所用到的幾種大規(guī)模組學(xué)方法，希望對(duì)各位專(zhuān)家有所幫助，不當(dāng)之處，請(qǐng)各位專(zhuān)家老師批評(píng)指正！

引言

在小麥(Triticum aestivum L.)研究和育種過(guò)程中，基因型與遺傳背景是非常重要的信息。“傳統(tǒng)”的、基于PCR的分子標(biāo)記(如簡(jiǎn)單序列重復(fù)和功能標(biāo)記)對(duì)于基因組大的物種來(lái)說(shuō)具有一些缺點(diǎn)，特別對(duì)于小麥這種包含三個(gè)亞基因組、含有超過(guò)80%重復(fù)序列的異源六倍體物種來(lái)說(shuō)，比如SSR標(biāo)記在基因組上的分布不均勻且密度較低。此外，分子標(biāo)記一般多用來(lái)檢測(cè)單個(gè)或數(shù)個(gè)位點(diǎn)，而在小麥研究中，比如漸滲系背景鑒定、關(guān)聯(lián)分析、QTL分析、基因定位等，往往需要鑒定多位點(diǎn)或者全基因組水平的遺傳多態(tài)性?，F(xiàn)在隨著新一代測(cè)序技術(shù)和DNA芯片技術(shù)的飛速發(fā)展，分子水平的基因檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)不斷完善和發(fā)展，基因檢測(cè)效率不斷提高而成本迅速下降，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于全基因組水平上檢測(cè)小麥遺傳背景，為新品種選育和品質(zhì)改良帶來(lái)了新的科研方法和解決方案。本文介紹了幾種全基因組水平多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)的常見(jiàn)方法，并比較了其優(yōu)缺點(diǎn)和在科學(xué)研究中的具體應(yīng)用。

一、全基因組重測(cè)序

全基因組重測(cè)序是對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。通過(guò)全基因組重測(cè)序和序列比對(duì)，可以挖掘到大量的變異位點(diǎn)，探索個(gè)體的遺傳變異。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，測(cè)序成本的不斷降低，越來(lái)越多的小麥族物種的全基因組測(cè)序工作相繼完成(Zhou et al., 2020)，重測(cè)序成為了群體進(jìn)化、背景選擇、關(guān)聯(lián)分析等研究應(yīng)用最為廣泛的方法。

重測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程是：基因組 DNA 的提取及檢測(cè)→DNA片段化→末端修復(fù) 添加接頭→文庫(kù)的PCR擴(kuò)增→文庫(kù)質(zhì)量的檢測(cè)→高通量測(cè)序。測(cè)序后得到的原始數(shù)據(jù)去除adapter、含N多的reads和低質(zhì)量的reads進(jìn)行質(zhì)控。質(zhì)控后的數(shù)據(jù)通過(guò)與參考基因組的序列比對(duì)，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)，插入缺失(insertion-deletion, InDel)位點(diǎn)。根據(jù)這些位點(diǎn)，結(jié)合質(zhì)量值、測(cè)序深度、重復(fù)性等因素作進(jìn)一步的過(guò)濾篩選，并可根據(jù)參考基因組信息對(duì)檢測(cè)到的變異和候選基因進(jìn)行注釋分析。

目前全基因組重測(cè)序還是主要使用第二代測(cè)序技術(shù)，基于Illumina的Hi-seq/Nova-seq和華大基因的T7平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。一般而言，二代測(cè)序讀長(zhǎng)一般為雙端150bp，足夠使大多數(shù)reads正確比對(duì)到小麥的亞基因組區(qū)域內(nèi)，我們統(tǒng)計(jì)雙端150bp reads正確重新比對(duì)回小麥基因組的比例覆蓋超90%的區(qū)域。當(dāng)測(cè)序深度在10 – 20X以上時(shí)，對(duì)基因組覆蓋度和測(cè)序錯(cuò)誤率的控制均得以保證。但在實(shí)際應(yīng)用中考慮到小麥基因組較大，成本較高，在目前已發(fā)表的重測(cè)序研究中測(cè)序深度大概在6 – 20X (Hao et al., 2020)。盡管在某些研究中測(cè)序深度較低，但仍可以鑒定出超過(guò)150萬(wàn)個(gè)多樣性位點(diǎn)，并應(yīng)用于下游的遺傳分析和關(guān)聯(lián)分析等(Yang et al., 2020)3(YANG Zheng-Zhao et al., 2020)。對(duì)于源于遺傳背景清楚的雙親或多親本群體，比如近等基因系、重組自交系、多親本重組系等，使用極低覆蓋率(0.1 – 1X)的測(cè)序數(shù)據(jù)，并借助概率統(tǒng)計(jì)策略也可較為清晰的鑒定其遺傳背景。

除了鑒定單堿基變異和小片段的插入缺失，全基因組重測(cè)序也可以應(yīng)用于結(jié)構(gòu)變異(structural variation, SV)和拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)研究，但在小麥中這方面的研究還較少。相對(duì)于其他方法，全基因組重測(cè)序可以鑒定全基因組的變異情況，并發(fā)掘新的位置變異位點(diǎn)，并且在數(shù)據(jù)后續(xù)處理和應(yīng)用上也可以隨著基因組信息的更新繼續(xù)得到更新。

二、外顯子捕獲測(cè)序

第二代測(cè)序結(jié)合微陣列技術(shù)衍生出目標(biāo)序列捕獲測(cè)序技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)首先利用微陣列技術(shù)合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，從而富集到特定區(qū)段，然后對(duì)這些區(qū)段測(cè)序，目前應(yīng)用最多就是外顯子捕獲測(cè)序。外顯子捕獲測(cè)序(whole exome sequencing, WES)是指利用靶向捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域捕獲并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法。通過(guò)捕獲芯片去捕獲基因組上感興趣的區(qū)域，相比于全基因組重測(cè)序來(lái)說(shuō)，大大減少了測(cè)序費(fèi)用，更經(jīng)濟(jì)高效，而且數(shù)據(jù)分析計(jì)算量小，與生物學(xué)表型結(jié)合更為直接。小麥外顯子常用的捕獲區(qū)域大概300MB，可以以較少的數(shù)據(jù)量獲得高深度覆蓋，進(jìn)而準(zhǔn)確地鑒定出包括SNP、InDel和CNV在內(nèi)的各種變異類(lèi)型。

捕獲測(cè)序現(xiàn)在有兩種策略，其一是基于芯片的混合捕獲法，即固相捕獲法，將感興趣的基因組區(qū)域定制成特異性探針，固定在固體支持物上的探針與基因組DNA進(jìn)行雜交、富集并測(cè)序。由于在花費(fèi)和操作上的劣勢(shì)，已基本被淘汰。其二是溶液捕獲法，通過(guò)合成大量特定的寡核苷酸探針，并在溶液中與目標(biāo)片段雜交，探針選擇性雜交到感興趣的基因組區(qū)域，洗去游離DNA后對(duì)捕獲的目標(biāo)基因組片段進(jìn)行測(cè)序。以上這兩類(lèi)文庫(kù)的一般測(cè)序流程是：基因組 DNA 的提取及檢測(cè)→構(gòu)建片段文庫(kù)→目標(biāo)片段的富集→富集文庫(kù)的擴(kuò)增→文庫(kù)質(zhì)量的檢測(cè)→高通量測(cè)序。其三是現(xiàn)在迅速發(fā)展的多重PCR擴(kuò)增子捕獲法，是基于多重PCR技術(shù)或寡核苷酸探針雜交的快速富集方法，其通過(guò)設(shè)計(jì)可特異擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的引物捕獲目標(biāo)區(qū)域，并再通過(guò)嵌套引物構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，大大降低了捕獲測(cè)序的成本。這三種捕獲技術(shù)相比較來(lái)說(shuō)，芯片雜交和溶液雜交分別是通過(guò)增加樣品量或探針量以促進(jìn)雜交反應(yīng)的進(jìn)行，建庫(kù)一般需要100ng以上的樣本，步驟相對(duì)較多，操作較復(fù)雜，但數(shù)據(jù)量大，捕獲區(qū)域可以較大，并且對(duì)大片段插入缺失的檢測(cè)有一定優(yōu)勢(shì)；而多重PCR擴(kuò)增所需樣本量一般在1 - 10ng即可，操作步驟簡(jiǎn)單，然而捕獲區(qū)域較小(每組反應(yīng)一般小于＜100k)，但成本非常低廉。

基于小麥特定品種設(shè)計(jì)的全外顯子捕獲芯片在實(shí)際應(yīng)用中較多，可以利用外顯子測(cè)序技術(shù)設(shè)計(jì)超高密度多重引物探針，在小麥全基因組DNA水平上對(duì)超過(guò)16萬(wàn)個(gè)基因外顯子進(jìn)行特異性捕獲。最新發(fā)布的小麥外顯子捕獲芯片有基于中國(guó)春1.1版本的TA-WES-CS芯片、基于國(guó)內(nèi)品種“矮抗58”的TA-WES-AK58芯片、科農(nóng)9204全外顯子芯片、Fielder全外顯子芯片等，其中WES-AK58芯片是目前國(guó)內(nèi)覆蓋基因區(qū)域(290M)最大的外顯子芯片，包含基因CDS區(qū)域及啟動(dòng)子區(qū)域?，F(xiàn)在隨著表觀基因組學(xué)研究，小麥的調(diào)控區(qū)被鑒定出來(lái)，相應(yīng)的調(diào)控區(qū)捕獲芯片也逐漸走向市場(chǎng)。

三、 基于RNA-seq的變異檢測(cè)

RNA-seq是研究轉(zhuǎn)錄組的常用手段，在之前的研究中也有應(yīng)用RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)的策略。其商業(yè)化建庫(kù)流程已經(jīng)較為成熟，大致包括：RNA的提取→高鹽片段化→反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA →接頭連接→文庫(kù)擴(kuò)增→質(zhì)檢上機(jī)。其優(yōu)勢(shì)主要有：一是可以直接得到表達(dá)的編碼區(qū)序列變異信息，小麥中單個(gè)組織中表達(dá)基因超過(guò)8萬(wàn)個(gè)(Ramirez-Gonzalez et al., 2018)，表達(dá)量較高位點(diǎn)大多擁有足夠的reads覆蓋用以鑒定高質(zhì)量的SNP、InDel等變異；二是可以獲得轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的信息，包括基因表達(dá)量、可變剪切等。然而，相對(duì)于外顯子捕獲技術(shù)來(lái)說(shuō)，因?yàn)楸磉_(dá)基因僅是全部基因中的一部分，且存在豐度差異，導(dǎo)致將RNA-seq用于序列變異的獲取時(shí)，覆蓋度低?？紤]到RNA-seq建庫(kù)的對(duì)樣品的獲取和存儲(chǔ)、建庫(kù)的成本和技術(shù)要求較高，現(xiàn)在單純應(yīng)用于多樣性檢測(cè)的方式已較為有限。

近些年，使用RNA-seq進(jìn)行分離群體的BSA (Bulked-Segregant Analysis)或連鎖分析可定位功能基因，BSA即集群分離分析法，是從近等基因系分析法演變而來(lái)的，可以和RNA-seq相結(jié)合進(jìn)行基因定位，這種方法就是BSR-Seq (Bulked Segregant RNA-Seq) (Edae and Rouse, 2019)。通過(guò)在分離群體中選擇性狀極端的或是目標(biāo)性狀差異明顯的個(gè)體構(gòu)建兩個(gè)混合池，提取混合池RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，根據(jù)混池個(gè)數(shù)和物種基因組大小來(lái)設(shè)定測(cè)序深度，最后分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并預(yù)測(cè)目標(biāo)基因所在的基因組區(qū)段。這種方法只對(duì)mRNA 測(cè)序，去除了大量的重復(fù)序列和無(wú)用序列，對(duì)于大基因組物種來(lái)說(shuō)，減少了測(cè)序成本，比基于全基因組重測(cè)序的 BSA 有一定的優(yōu)勢(shì)，但不足就是樣本量大的時(shí)候才能代表該群體真實(shí)的情況，選擇少量樣本可能會(huì)帶來(lái)誤差。

四、DNA芯片

DNA芯片的工作原理是在一個(gè)高密度芯片上固定大量可以代表生物整個(gè)基因組或部分基因組的核酸探針，比如外顯子、miRNA、單核苷酸多態(tài)性SNP等等，探針與樣品中的靶序列在一定條件下發(fā)生雜交反應(yīng)，通過(guò)熒光、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的方法讀取每個(gè)位點(diǎn)的復(fù)雜信息，是在原來(lái)核酸雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。相較于其他檢測(cè)技術(shù)來(lái)說(shuō)，成本低，數(shù)據(jù)處理又快又簡(jiǎn)單，也可靈活設(shè)計(jì)樣本數(shù)量和探針位點(diǎn)、基因分型準(zhǔn)確。但芯片分析依賴(lài)于已知的基因組信息，覆蓋率較低，且只能檢測(cè)固定的基因型，不可以檢測(cè)片段插入和缺失，也是該技術(shù)的最大局限。

DNA芯片在多倍體小麥的目標(biāo)基因分型和分子標(biāo)記輔助選擇中已經(jīng)廣泛應(yīng)用。一般用SNP芯片進(jìn)行檢測(cè)的流程是；對(duì)符合實(shí)驗(yàn)要求的核酸樣品進(jìn)行線性擴(kuò)增→沉淀并收集目標(biāo)片段→對(duì)符合上機(jī)實(shí)驗(yàn)的核酸樣品進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)→進(jìn)行芯片的洗染掃描實(shí)驗(yàn)→分析下機(jī)數(shù)據(jù)，完成數(shù)據(jù)質(zhì)控。其中需要注意的是，雜交條件的選擇與研究目的有關(guān)，雜交時(shí)間、嚴(yán)謹(jǐn)性、樣品濃度和雜交溫度等都會(huì)影響檢測(cè)的特異性和低拷貝基因檢測(cè)的靈敏度。在進(jìn)行突變體檢測(cè)和SNP分析時(shí)，要鑒別出單堿基錯(cuò)配，需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時(shí)間?？傮w來(lái)說(shuō)SNP芯片技術(shù)具有特異性高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、高通量等優(yōu)點(diǎn)。

迄今為止已經(jīng)設(shè)計(jì)了一系列不同密度SNP芯片用于普通小麥的標(biāo)記輔助育種，如小麥9K，15K，35K，45K，60K，55K，90K，820K和660K芯片等。其中TA-45K、60K、120K和660K芯片都是基于前期構(gòu)建的大規(guī)?；蛐蛿?shù)據(jù)庫(kù)(覆蓋國(guó)內(nèi)大部分小麥品種)在2000份材料中篩選的多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成，分別選取了基因組上4.43萬(wàn)、6.1萬(wàn)、12萬(wàn)和16萬(wàn)個(gè)多態(tài)性區(qū)域，包含不同多態(tài)性位點(diǎn)。Sun等人從SNP序列數(shù)量、分布、密度、相關(guān)基因、雜合度和應(yīng)用等方面對(duì)其進(jìn)行了比較七種基因芯片，結(jié)果表明，小麥660K SNP芯片包含最高比例(99.05%)的基因組特異性SNP，幾乎均勻分布在整個(gè)基因組中，具有可靠的物理位置，且有229個(gè)SNP位于啟動(dòng)子區(qū)間，幾乎涵蓋了小麥35K (97.44%)、55K (99.73%)、90K (86.9%)和820K (85.3%) SNP陣列顯示的所有基因，現(xiàn)在小麥660K芯片已經(jīng)成為小麥研究中應(yīng)用最為廣泛的DNA芯片(Sun et al., 2020)。

以上幾種高通量測(cè)序技術(shù)都有其優(yōu)缺點(diǎn)(圖1)，由于小麥基因組復(fù)雜龐大，在測(cè)序成本不能快速下降的情況下，DNA芯片現(xiàn)在仍具有較多的應(yīng)用場(chǎng)景。而隨著測(cè)序成本的進(jìn)一步降低，考慮到數(shù)據(jù)的再挖掘和信息更新，全基因組重測(cè)序在未來(lái)可能應(yīng)用更為廣泛。全外顯子捕獲測(cè)序探針合成成本較高，導(dǎo)致建庫(kù)費(fèi)用下降緩慢，隨著測(cè)序成本的下降，應(yīng)用已經(jīng)逐漸減少。而應(yīng)用多重PCR的目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序在較少規(guī)模位點(diǎn)檢測(cè)(如基因編輯位點(diǎn)、特定基因變異檢測(cè))等方面具有較大的應(yīng)用場(chǎng)景。使用RNA-seq進(jìn)行序列變異分析的研究也已經(jīng)較少，但BSR-seq的應(yīng)用在基因定位中越來(lái)越多。此外，隨著三代測(cè)序技術(shù)的低成本化，應(yīng)用三代測(cè)序進(jìn)行變異研究，尤其是在結(jié)構(gòu)變異上進(jìn)行研究也是未來(lái)全基因組變異檢測(cè)的重要方向。

參考文獻(xiàn)

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Hao, C., Jiao, C., Hou, J., Li, T., Liu, H., Wang, Y., Zheng, J., Liu, H., Bi, Z., Xu, F., et al. (2020). Resequencing of 145 Landmark Cultivars Reveals Asymmetric Sub-genome Selection and Strong Founder Genotype Effects on Wheat Breeding in China. Mol Plant 13, 1733-1751.

Ramirez-Gonzalez, R.H., Borrill, P., Lang, D., Harrington, S.A., Brinton, J., Venturini, L., Davey, M., Jacobs, J., van Ex, F., Pasha, A., et al. (2018). The transcriptional landscape of polyploid wheat. Science 361.

Sun, C., Dong, Z., Zhao, L., Ren, Y., Zhang, N., and Chen, F. (2020). The Wheat 660K SNP array demonstrates great potential for marker-assisted selection in polyploid wheat (vol 18, pg 1354, 2020). Plant Biotechnol J 18, 1635-1635.

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