今天給同學(xué)們分享一篇一種新型lncRNA促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的生信文章“A novel lncRNA RP11-386G11.10 reprograms lipid metabolism to promote hepatocellular carcinoma progression”，這篇文章于2022年月5日發(fā)表在Mol Metab雜志上，IF=8.568。研究的結(jié)果表明lncRNA-RP11-386G11.10是一種新型致癌lncRNA，與HCC的不良預(yù)后密切相關(guān)。ZBTB7A-RP11-386G11.10-HNRNPU正反饋回路通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成代謝促進(jìn)HCC的進(jìn)展。RP11-386G11.10可能成為肝細(xì)胞癌（HCC）新診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1.lncRNA-RP11-386G11.10 在HCC組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)

為了探索HCC相關(guān)lncRNA的作用，作者篩選了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)并確定了一個(gè)新的lncRNA-RP11-386G11.10 ，它在所有類型的癌癥和癌癥中都過(guò)表達(dá)HCC中與預(yù)后相關(guān)的、保守的和非蛋白質(zhì)編碼的細(xì)胞系。作者生成了Kaplan-Meier生存曲線，發(fā)現(xiàn)RP11-386G11.10高表達(dá)的患者預(yù)后較差（圖1A，圖1B）。對(duì)80對(duì)HCC和非腫瘤組織的QRT-PCR生信分析以及按RP11-386G11.10表達(dá)分層的患者的生存分析證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)（圖1C，圖1D）。此外，單因素方差生信分析顯示，HCC組織中RP11-386G11.10的表達(dá)與預(yù)后不良、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、巴塞羅那臨床肝癌（BCLC）分期和門靜脈呈正相關(guān)。靜脈腫瘤血栓形成(PVTT)(圖1E)?；赨CSC基因組瀏覽器數(shù)據(jù)庫(kù)和編碼潛力計(jì)算器2（CPC2）工具的生信分析表明，RP11-386G11.10是保守的且非蛋白質(zhì)編碼（圖1D，圖S1E）。作者使用5'-和3'-RACE生信分析來(lái)獲得RP11-386G11.10的全長(zhǎng)。接下來(lái)，與L02正常人肝細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞（HepG2、Hep3B、Li7、Huh-7和HCC-LM3）中RP11-386G11.10mRNA水平上調(diào)，并且在Huh-7和HCC-中上調(diào)最多。LM3細(xì)胞（圖1F）。此外，核質(zhì)RNA分離和FISH結(jié)果顯示RP11-386G11.10主要位于細(xì)胞質(zhì)中（圖1G，圖1H）。作者的結(jié)果表明lncRNA-RP11-386G11.10 在HCC中上調(diào)，這種上調(diào)可能與HCC的進(jìn)展有關(guān)。

圖1 RP11-386G11.10表達(dá)在HCC中顯著增加

2. lncRNA-RP11-386G11.10 在體內(nèi)和體外促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

為了進(jìn)一步闡明RP11-386G11.10的生物學(xué)功能，作者使用Huh-7和HCC-LM3細(xì)胞系建立了敲低模型（圖2A）。細(xì)胞增殖測(cè)定表明，RP11-386G11.10敲低顯著抑制了HCC細(xì)胞的增殖（圖2B，圖2C）。Transwell侵襲試驗(yàn)和傷口愈合試驗(yàn)結(jié)果表明，敲除RP11-386G11.10顯著降低了HCC細(xì)胞的侵襲和遷移能力（圖2D，圖2E）。并且RP11-386G11.10過(guò)表達(dá)增加了細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。為了進(jìn)一步探索RP11-386G11.10在體內(nèi)的作用，作者將shNC或RP11-386G11.10-sh2HCC-LM3細(xì)胞皮下注射到BALB/c裸鼠中。與shNC組相比，RP11-386G11.10-sh2組的腫瘤體積和重量顯著減少（圖2F）。此外，IHC結(jié)果顯示，敲除RP11-386G11.10顯著降低了ki-67的表達(dá)（圖2G）。作者還建立了體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)RP11-386G11.10-sh2組肺和肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較少（圖2H，I）。綜上所述，與shNC相比，該lncRNA在體內(nèi)和體外均促進(jìn)了HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

圖2 RP11-386G11.10促進(jìn)HCC增殖和轉(zhuǎn)移

3. lncRNA-RP11-386G11.10 促進(jìn)HCC發(fā)展并增加HCC中的從頭脂質(zhì)合成

為了徹底研究RP11-386G11.10調(diào)節(jié)HCC發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，作者進(jìn)行了RNA-seq以鑒定Huh-7細(xì)胞中RP11-386G11.10敲低后的潛在基因。RNA-seq數(shù)據(jù)顯示RP11-386G11.10敲低導(dǎo)致總共687個(gè)基因的差異表達(dá)，包括477個(gè)上調(diào)基因和210個(gè)下調(diào)基因（圖3A）。熱圖顯示了每個(gè)樣本中所有差異表達(dá)基因的表達(dá)（圖3B）。KEGG通路生信分析表明，脂肪酸代謝信號(hào)通路是最顯著富集的通路之一（圖3C）。然后作者下載了GESA的TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)與RP11-386G11.10共表達(dá)的基因在脂肪酸(FA)代謝中顯著富集（圖3D）。由于異常的脂質(zhì)代謝被認(rèn)為與HCC的進(jìn)展有關(guān)，作者評(píng)估了RP11-386G11.10是否影響HCC細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝。與對(duì)照細(xì)胞相比，RP11-386G11.10敲低的HCC細(xì)胞中的甘油三酯和膽固醇水平顯著降低（圖3E）。氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)FAs的含量，如棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸和油酸,被RP11-386G11.10擊倒顯著減少(圖3F)。此外，如尼羅紅染色所示，RP11-386G11.10敲低抑制了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累（圖3G）。接下來(lái)，作者確定了RP11-386G11.10調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞異常脂質(zhì)代謝的機(jī)制。作者檢查了80個(gè)HCC組織樣本中脂質(zhì)代謝基因的mRNA水平。Pearson相關(guān)生信分析顯示，一些脂質(zhì)代謝基因的mRNA水平，包括脂肪生成酶脂肪酸合酶（FASN），ATP-檸檬酸裂解酶（ACLY）,乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)與RP11-386G11.10具有顯著相關(guān)性(圖3H)。qRT-PCR和westernbolt結(jié)果表明，敲除RP11-386G11.10降低了HCC細(xì)胞中FASN、ACC、ACLY和SCD等關(guān)鍵脂質(zhì)合成基因的表達(dá)（圖3I-J）。此外，參與脂質(zhì)攝取、合成、β-氧化和輸出的其他相關(guān)基因的表達(dá)沒(méi)有顯著變化。在過(guò)表達(dá)RP11-386G11.10的細(xì)胞中，觀察到上述脂質(zhì)代謝的相反變化。裸鼠皮下腫瘤的IHC生信分析表明，敲除RP11-386G11.10可降低體內(nèi)FASN、ACC、ACLY、SCD和其他基因的蛋白表達(dá)（圖3K）。總之，作者的結(jié)果表明，RP11-386G11.10促進(jìn)了HCC細(xì)胞中的脂質(zhì)積累。

圖3 RP11-386G11.10促進(jìn)HCC中的脂質(zhì)合成

4. lncRNA-RP11-386G11.10 通過(guò)充當(dāng)ceRNA負(fù)向調(diào)節(jié)miR-345-3p

LncRNAs通過(guò)多種不同的機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，大多數(shù)lncRNAs通過(guò)充當(dāng)miRNAs的分子海綿來(lái)發(fā)揮其功能。因此，作者假設(shè)RP11-386G11.10也可能作為HCC中的ceRNA與miRNA相互作用。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)miRDB和LncBase用于預(yù)測(cè)RP11-386G11.10和miRNA之間可能的相互作用，預(yù)測(cè)RP11-386G11.10可能調(diào)節(jié)11種miRNA（圖4A）。對(duì)公共TCGA數(shù)據(jù)集的生信分析表明，與配對(duì)的非腫瘤組織相比，HCC組織中5種miRNA的表達(dá)顯著降低（圖4B）。在RP11-386G11.10過(guò)表達(dá)或敲低后，miR-345-3p的表達(dá)表現(xiàn)出最明顯的變化（圖4C）。此外，對(duì)80個(gè)HCC組織的Pearson生信分析顯示，RP11-386G11.10和miR-345-3p的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（圖4D），表明RP11-386G11.10可能是miR-345-3p的ceRNA。為了證實(shí)上述推測(cè)，作者使用miRNA模擬物/抑制劑分別上調(diào)/敲低mi-345-3p的表達(dá)，并構(gòu)建了WT和MUTRP11-386G11.10報(bào)告質(zhì)粒（圖4E）。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-345-3p的RP11-386G11.10-WT細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性與對(duì)照細(xì)胞相比顯著降低，而敲低miR-345-3p顯著增加RP11-386G11.10-WT細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性（圖4F）。相反，在RP11-386G11.10-MUT細(xì)胞中未檢測(cè)到此類變化（圖4F）。此外，RIP生信分析顯示RP11-386G11.10和mi-345-3p與沉淀復(fù)合物中的抗Ago2抗體結(jié)合，但不與IgG對(duì)照結(jié)合（圖4G）。因此，作者的結(jié)果表明，RP11-386G11.10含有miR-345-3p的結(jié)合位點(diǎn)，并作為ceRNA負(fù)調(diào)控miR-345-3p。

圖4 RP11-386G11.10直接與miR-345–3p結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-345–3p表達(dá)

5. MiR-345-3p抑制HCC進(jìn)展

鑒于RP11-386G11.10可能通過(guò)海綿化miR-345-3p發(fā)揮作用，作者進(jìn)一步研究了miR-345-3p的生物學(xué)功能。作者的結(jié)果表明，miR-345-3p過(guò)表達(dá)受到抑制，而miR-345-3p敲低促進(jìn)了HCC細(xì)胞的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力（圖5A-D）。作者接下來(lái)使用皮下異種移植、尾靜脈注射和脾內(nèi)注射模型來(lái)探索miR-345-3p在體內(nèi)的作用。miR-345-3p過(guò)表達(dá)組的腫瘤體積和重量均顯著降低（圖5E）。在尾靜脈注射和脾內(nèi)注射模型中，miR-345-3p敲低增強(qiáng)了肺和肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（圖5F-G）?？傊?，這些結(jié)果表明miR-345-3p在體外和體內(nèi)抑制HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

圖5 MiR-345-3p抑制HCC中的增殖和轉(zhuǎn)移以及脂質(zhì)合成

6. miR-345-3p抑制HCC中的脂質(zhì)合成

作者驗(yàn)證了RP11-386G11.10和miR-345-3p之間的相互作用，這表明miR-345-3p也可能影響HCC中的脂質(zhì)合成。尼羅紅染色和HCC細(xì)胞中甘油三酯和膽固醇水平的測(cè)量結(jié)果表明，miR-345-3p的過(guò)表達(dá)/敲低分別抑制/促進(jìn)了HCC細(xì)胞中的脂質(zhì)積累（圖5H）。qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，合成代謝基因的表達(dá)分別被miR-345-3p過(guò)表達(dá)/敲低下調(diào)/上調(diào)（圖5I，圖5J）。上述結(jié)果表明miR-345-3p可以延緩HCC的進(jìn)展并抑制脂質(zhì)合成代謝。

7. HNRNPU是miR-345-3p的直接靶基因

為了明確miR-345-3p的直接靶基因，作者使用生信分析預(yù)測(cè)了17個(gè)可能參與HCC發(fā)生和發(fā)展的靶基因（圖6A），其中只有VPS4B和HNRNPU已被報(bào)道促進(jìn)HCC的發(fā)展。qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示miR-345-3p過(guò)表達(dá)/敲低可以下調(diào)/上調(diào)HNRNPUmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，而VPS4B表達(dá)沒(méi)有顯著變化（圖6B，圖6C）。對(duì)80個(gè)HCC組織的Pearson相關(guān)生信分析表明，miR-345-3p的表達(dá)與HNRNPU的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖6D）。然后，為了闡明HNRNPU是否直接受miR-345-3p調(diào)控，作者構(gòu)建了WT和MUTHNRNPU質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)miR-345-3p模擬轉(zhuǎn)染顯著降低了HNRNPU-WT細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性，而miR-345-3p抑制劑轉(zhuǎn)染顯示相反的效果（圖6E，圖6F）。相反，在HNRNPU-MUT細(xì)胞中未檢測(cè)到此類變化（圖6F）。此外，RIP檢測(cè)結(jié)果顯示miR-345-3p和HNRNPU與沉淀復(fù)合物中的抗Ago2抗體結(jié)合，但不與IgG對(duì)照結(jié)合（圖6G）。上述結(jié)果表明，miR-345-3p可以與HNRNPU中的靶位點(diǎn)結(jié)合，直接調(diào)控HNRNPU。

圖6 MiR-345–3p直接與HNRNPU結(jié)合并負(fù)調(diào)節(jié)HNRNPU表達(dá)

8.lncRNA-RP11-386G11.10通過(guò)miR-345-3p/HNRNPU軸促進(jìn)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

如先前文獻(xiàn)報(bào)道，HNRNPU通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)合成來(lái)促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。如對(duì)TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集的生信分析所示，HNRNPU在HCC中高表達(dá)并與不良預(yù)后相關(guān)。為了闡明RP11-386G11.10是否通過(guò)miR-345-3p/HNRNPU軸調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞中HCC和脂質(zhì)合成代謝的進(jìn)展，作者將miR-345-3p抑制劑或HNRNPU質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到RP11-386G11.10敲低HCC中細(xì)胞。通過(guò)敲低RP11-386G11.10降低了HNRNPU表達(dá)，并且正如預(yù)期的那樣，這種抑制被miR-345-3p抑制劑逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明，miR-345-3p敲低和HNRNPU過(guò)表達(dá)都逆轉(zhuǎn)了RP11-386G11.10敲低誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的降低（圖7B-E）。然后作者將miR-345-3p抑制劑和HNRNPU質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到RP11-386G11.10敲低細(xì)胞中，并通過(guò)皮下注射將這些細(xì)胞植入BALB/c裸鼠中。與shNC組相比，MiR-345-3p抑制或HNRNPU過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了RP11-386G11.10-sh2組中腫瘤體積和重量的顯著減少（圖6F）。這些結(jié)果表明RP11-386G11.10作為miR-345-3p的ceRNA調(diào)節(jié)HNRNPU的表達(dá)，導(dǎo)致HCC的發(fā)展。

圖7 RP11-386G11.10通過(guò)miR-345–3p/HNRNPU軸促進(jìn)HCC中的細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移以及脂質(zhì)合成

9. RP11-386G11.10、miR-345-3p、HNRNPU軸介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝是HCC進(jìn)展的原因

作者觀察到腫瘤切片中RP11-386G11.10敲低引起的脂質(zhì)水平降低被miR-345-3p抑制劑轉(zhuǎn)染和HNRNPU過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)（圖7G，圖7H）。此外，miR-345-3p抑制和HNRNPU過(guò)表達(dá)都逆轉(zhuǎn)了RP11-386G11.10敲低誘導(dǎo)的關(guān)鍵脂質(zhì)合成基因（如FASN、ACC、ACLY和SCD）的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)（圖7I，圖7J）。在HCC細(xì)胞系中也觀察到相同的變化。這些結(jié)果表明，RP11-386G11.10通過(guò)由miR-345-3p/HNRNPU軸調(diào)節(jié)的脂質(zhì)合成代謝促進(jìn)HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

10. ZBTB7A是lncRNA-RP11-386G11.10 的轉(zhuǎn)錄因子

最后，為了闡明RP11-386G11.10在HCC中的過(guò)表達(dá)，作者使用hTFtarget、geneCARDS和UCSCGenomeBrowser數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)TATA-box結(jié)合蛋白(TBP)和ZBTB7A可能是調(diào)節(jié)RP11-386G11.10的轉(zhuǎn)錄因子（圖8A），作者發(fā)現(xiàn)兩種TF在HCC組織中均過(guò)表達(dá)。擊倒ZBTB7A顯著降低了RP11-386G11.10的表達(dá)（圖8B）。然而，RP11-386G11.10表達(dá)在TBP敲低后沒(méi)有顯著變化。為了驗(yàn)證ZBTB7A對(duì)RP11-386G11.10發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，作者根據(jù)啟動(dòng)子生信分析工具預(yù)測(cè)的RP11-386G11.10和ZBTB7A結(jié)合位點(diǎn)(GGCGCCCACCAC)的序列構(gòu)建了WT和MUTRP11-386G11.10質(zhì)粒（UCSC和JASPAR）（圖8C）。然后，作者用HCC細(xì)胞構(gòu)建了ZBTB7A過(guò)表達(dá)模型，發(fā)現(xiàn)ZBTB7A過(guò)表達(dá)顯著增加了RP11-386G11.10-WT細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性，而ZBTB7A敲低則顯示出相反的效果（圖8D）。相反，在RP11-386G11.10-MUT細(xì)胞中未檢測(cè)到此類變化（圖8D）。此外，ChIP-qPCR的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)ZBTB7A直接與RP11-386G11.10的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合（圖8E）。

圖8 RP11-386G11.10直接受轉(zhuǎn)錄因子ZBTB7A調(diào)控

11. HNRNPU形成一個(gè)正反饋回路，通過(guò)激活ZBTB7A促進(jìn)lncRNA-RP11-386G11.10 的表達(dá)

基于RP11-386G11.10、ZBTB7A和HNRNPU在HCC中高表達(dá)的研究結(jié)果，并且三者之間存在強(qiáng)相關(guān)性，作者假設(shè)RP11-386G11.10對(duì)HCC的強(qiáng)促進(jìn)作用進(jìn)展和脂質(zhì)合成是由于潛在的正反饋循環(huán)。HNRNPU敲低降低了ZBTB7A的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平以及RP11-386G11.10的mRNA表達(dá)水平（圖8F-G）。據(jù)報(bào)道，HNRNPU通過(guò)穩(wěn)定下游靶基因mRNA促進(jìn)癌癥進(jìn)展，并且作者觀察到在HNRNPU敲低后，HCC細(xì)胞中ZBTB7AmRNA的穩(wěn)定性如預(yù)期的那樣降低（圖8H）。此外，HNRNPU過(guò)表達(dá)增加了RP11-386G11.10-WT細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性（圖8I）。ZBTB7A敲低逆轉(zhuǎn)了HNRNPU過(guò)表達(dá)對(duì)RP11-386G11.10-WT細(xì)胞的影響，但在RP11-386G11.10-MUT細(xì)胞中未觀察到顯著變化，這表明HNRNPU促進(jìn)了ZBTB7A與RP11-386G11.10的結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域（圖8I）。此外，ZBTB7A或HNRNPU的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了RP11-386G11.10的表達(dá)，并且這種效應(yīng)被ZBTB7A的敲低逆轉(zhuǎn)，在熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)中觀察到相同的趨勢(shì)。上述結(jié)果表明，HNRNPU通過(guò)形成激活RP11-386G11.10的正反饋環(huán)來(lái)穩(wěn)定ZBTB7AmRNA以促進(jìn)HCC進(jìn)展和脂質(zhì)積累。

總結(jié)

總之，作者提出了 lncRNA 介導(dǎo)的 HCC 進(jìn)展中脂質(zhì)代謝重編程的新機(jī)制，并擴(kuò)大了對(duì) lncRNA 介導(dǎo)的 HCC 代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的理解。此外，由于脂肪生成在正常細(xì)胞中并不常見，因此針對(duì)脂肪生成酶及其信號(hào)級(jí)聯(lián)的方法對(duì)于開發(fā)用于癌癥治療的創(chuàng)新藥物非常有希望。從這個(gè)角度來(lái)看，作者的研究為HCC提供了可能的預(yù)后指標(biāo)，并為開發(fā)新的HCC治療藥物和策略鋪平了道路。對(duì)lncRNA的生信思路感興趣的老師，歡迎掃碼咨詢。