經(jīng)修飾表達(dá)后的嵌合抗原受體(CAR)的T細(xì)胞代表細(xì)胞治療和個(gè)體化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大進(jìn)展。在這一方法中，患者的T細(xì)胞會(huì)被分離出來(lái)，并被改造成表達(dá)一種與腫瘤抗原結(jié)合的合成受體，以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。

這些CAR-T細(xì)胞隨后在體外擴(kuò)增到有臨床治療意義的數(shù)量后，重新注入患者體內(nèi)，用于癌癥免疫治療。這些T細(xì)胞效力兼具T細(xì)胞的效應(yīng)器功能和抗體特異性、結(jié)合親和力。

CAR的胞外區(qū)存在由抗體的可變重鏈和可變輕鏈通過(guò)短肽接頭融合組成的抗原結(jié)合單鏈可變片段。細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)域包括一個(gè)來(lái)自T細(xì)胞受體(TCR)CD3z鏈的信號(hào)分子，以及取決于CAR結(jié)構(gòu)的其他可選特征。

以CD19為靶抗原的CAR-T細(xì)胞首次被用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤，在化療無(wú)效和復(fù)發(fā)的疾病中產(chǎn)生了顯著的臨床反應(yīng)?；谶@一成功，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了兩種自體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品:Tisagenlecleucel(Kymriah)&axicabagene cilleucel(Yescarta)

基于第二階段關(guān)鍵Eliana試驗(yàn)的結(jié)果，Kymriah被批準(zhǔn)用于25歲以下復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞前體急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者，該試驗(yàn)報(bào)告總有效率(ORR)為81%，其中60%的患者已完全緩解(CR)。

經(jīng)Zuma-1試驗(yàn)后，Yescarta被批準(zhǔn)用于患有大B細(xì)胞淋巴瘤且已接受過(guò)二線治療的成年患者。該試驗(yàn)報(bào)告的ORR為82%，CR率為54%，42%的患者觀察到持續(xù)反應(yīng)。

盡管這種療法很有效，臨床上也取得了成功，但自體CAR-T細(xì)胞仍有一些局限性。首先從臨床的角度來(lái)看，不是所有患者都可以接受CAR-T療法。例如，一些癌癥患者在患有嚴(yán)重的T細(xì)胞減少癥的同時(shí)接受了大量的預(yù)治療，可能就無(wú)法收集到滿足臨床相關(guān)劑量要求字體的CAR-T細(xì)胞。此外，生產(chǎn)自體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的過(guò)程漫長(zhǎng)，物流也很繁瑣。因此，病情進(jìn)展迅速的患者通常不適合這種療法。

CAR-T細(xì)胞的另一個(gè)局限性是它們的毒性特征，臨床表明，在接受這種療法的患者中，特別是那些患有嚴(yán)重或高負(fù)擔(dān)疾病的患者，發(fā)生細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)和免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征(ICANS)的風(fēng)險(xiǎn)很大。幸運(yùn)的是，這些炎癥綜合征的共識(shí)分級(jí)和管理指南進(jìn)步顯著改善了患者預(yù)后。

CAR-T細(xì)胞治療后的靶抗原丟失可能會(huì)帶來(lái)另一個(gè)臨床問(wèn)題，因?yàn)镃AR-T細(xì)胞的殺傷依賴于CAR的參與；也就是說(shuō)，靶抗原丟失會(huì)使這些免疫細(xì)胞無(wú)法發(fā)揮作用。正在為同種異體CAR-T細(xì)胞探索現(xiàn)成的治療方法，但考慮到它們與移植物抗宿主病(GVHD)的風(fēng)險(xiǎn)，同種異體CAR-T細(xì)胞將需要進(jìn)一步的基因修飾，例如刪除TCR，以降低這種風(fēng)險(xiǎn)。

鑒于CAR-T細(xì)胞治療的上述局限性以及患者的特定臨床和疾病相關(guān)特征，使用CAR自然殺傷(NK)細(xì)胞的替代方法，可能避免這些問(wèn)題。

圖1.NK細(xì)胞激活和抑制受體的譜系

NK細(xì)胞是CD3-CD56 的先天淋巴樣細(xì)胞，在宿主對(duì)感染性物質(zhì)和惡性腫瘤的防御中發(fā)揮基礎(chǔ)作用。與T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞可以在不需要事先預(yù)置抗原的情況下殺死轉(zhuǎn)移細(xì)胞，其殺傷能力不受靶細(xì)胞表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的限制。

因此，NK細(xì)胞能夠區(qū)分正常細(xì)胞和“應(yīng)激”細(xì)胞。健康細(xì)胞則幸免于難，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)與NK細(xì)胞上的抑制性受體結(jié)合的自身MHC I類分子，這樣就傳遞了一個(gè)“不被殺死”的信號(hào)，而轉(zhuǎn)化或感染的細(xì)胞下調(diào)了MHC I類分子或上調(diào)了應(yīng)激誘導(dǎo)的分子，如MICA/MICB和ULBP，它們與激活的受體如NKG2D結(jié)合，向NK細(xì)胞傳遞激活信號(hào)以進(jìn)行殺傷。因此，通過(guò)下調(diào)MHC-I類分子逃脫T細(xì)胞殺傷的腫瘤細(xì)胞“逃不過(guò)”NK細(xì)胞的追殺。

與T細(xì)胞相比，NK細(xì)胞的另一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是它們不會(huì)導(dǎo)致同種異體GVHD環(huán)境,這使它們得以成為一種第三方、現(xiàn)成的細(xì)胞治療方案。

同種異體NK細(xì)胞也不太容易被受體同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞排斥。許多臨床前研究表明，移植物中的NK細(xì)胞可以靶向并殺傷宿主淋巴造血細(xì)胞，這些細(xì)胞可能參與了供體細(xì)胞的排斥反應(yīng)。臨床數(shù)據(jù)證實(shí)，盡管人類白細(xì)胞抗原不匹配，但過(guò)繼轉(zhuǎn)移的CAR-NK細(xì)胞在患者體內(nèi)至少持續(xù)一年低水平存在，這一發(fā)現(xiàn)支持NK細(xì)胞可能不太容易受到宿主對(duì)移植物排斥反應(yīng)的觀點(diǎn)。因此，NK細(xì)胞在GVHD和移植物抗宿主病反應(yīng)方面的這些有利特征可能會(huì)在異基因環(huán)境中避免人類白細(xì)胞抗原配型。

盡管NK細(xì)胞具有許多優(yōu)勢(shì)，但一些限制可能會(huì)影響它們的療效：

• 沒(méi)有細(xì)胞因子支持的情況下只有1到2周的短暫壽命

• 需要體外擴(kuò)增和激活的細(xì)胞數(shù)量有限

• 對(duì)免疫抑制的腫瘤微環(huán)境敏感，這反過(guò)來(lái)又可能限制它們的運(yùn)輸和效應(yīng)功能。

工程學(xué)的進(jìn)步使研究人員能夠克服其中的一些限制。例如，在NK細(xì)胞中植入細(xì)胞因子轉(zhuǎn)基因(如IL-2或IL-15)可以增強(qiáng)其增殖能力和持久性，而植入趨化因子受體可以促進(jìn)其向腫瘤部位轉(zhuǎn)運(yùn)。

鑒于其獨(dú)特的生物學(xué)特性，其強(qiáng)大的先天抗腫瘤活性，以及在臨床上良好的安全性，自然殺傷細(xì)胞作為一種新興的CAR-T替代平臺(tái)在過(guò)去幾年中得到了相當(dāng)大的關(guān)注。純NK細(xì)胞可以分為自體( autologous )NK細(xì)胞（外周血、臍帶血。干細(xì)胞，包括誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞和造血干細(xì)胞）和同種異體NK細(xì)胞( allogeneic )（體外繁殖的NK細(xì)胞系，如NK-92）。來(lái)自癌癥患者的自體NK細(xì)胞的局限性，包括效應(yīng)器功能的降低和對(duì)患者特定產(chǎn)品的需要(類似于自體T細(xì)胞)，導(dǎo)致自體來(lái)源NK細(xì)胞在CAR工程興起。

表1.替代免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行CAR 的優(yōu)缺點(diǎn)

用于CAR-T的同種異體NK細(xì)胞來(lái)源多樣，每種來(lái)源都有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和局限性。臍帶血是同種異體NK細(xì)胞的現(xiàn)成來(lái)源，盡管數(shù)量很少，但由于其固有的高增殖能力，可以擴(kuò)充到相當(dāng)大的劑量。此外，可以在數(shù)十萬(wàn)個(gè)臍帶血的全球庫(kù)存中選擇與同種異體致敏患者沒(méi)有交叉反應(yīng)。

另一方面，外周血NK細(xì)胞表型成熟、功能強(qiáng)大。通過(guò)多能誘導(dǎo)生成的NK細(xì)胞是不成熟的，低表達(dá)抗體依賴細(xì)胞毒性誘導(dǎo)的CD16受體，但具有高度的增殖性，可以隨時(shí)用于生物庫(kù)。

最后，NK-92細(xì)胞等NK細(xì)胞系易于擴(kuò)增和操縱，但由于它們來(lái)自NK淋巴瘤患者的未分化NK細(xì)胞前體，它們?nèi)狈D16和一些殺傷免疫球蛋白樣受體的表達(dá)，并且由于它們的惡性潛能，在臨床使用前需要先進(jìn)行放射治療，這反過(guò)來(lái)可能限制它們?cè)隗w內(nèi)的持久性和有效性。

表2.評(píng)估以CAR為基礎(chǔ)的癌癥治療的替代免疫細(xì)胞的臨床試驗(yàn)

一項(xiàng)臨床前研究證實(shí)了這些來(lái)源的CAR-T NK細(xì)胞在體外和體內(nèi)一系列癌癥模型中的活性(Pfefferle等人綜述)。最近，正在探索CAR-NK細(xì)胞在不同惡性腫瘤中的療效(已完成或正在招募的臨床研究總結(jié)見(jiàn)表2)。我們進(jìn)行了CAR-NK細(xì)胞治療復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞惡性血液病患者的人類首個(gè)1/2期臨床試驗(yàn)(ClinicalTrials.gov編號(hào)NCT03056339)。NK細(xì)胞來(lái)源于臍帶血，且與接受者的HLA不合。

用于轉(zhuǎn)導(dǎo)NK細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼針對(duì)CD19抗原和IL-15的CAR，以增強(qiáng)NK細(xì)胞的持久性和功能。同時(shí)添加了一個(gè)可誘導(dǎo)的caspase 9自殺基因(ICas9)作為安全開(kāi)關(guān)。11名經(jīng)過(guò)預(yù)治療的患者接受了3種不同劑量水平的治療(每公斤1x10⁵,1x10⁶，或1x10⁷個(gè)細(xì)胞)。8人有反應(yīng)，總體應(yīng)答率為73%，其中7人完全緩解(64%)。這些反應(yīng)迅速，并在所有劑量水平上都能看到。

重要的是，包括CRS、ICAN或移植物抗宿主病在內(nèi)的嚴(yán)重毒副作用在所有患者中都沒(méi)有發(fā)生。

作為CAR-T的替代平臺(tái)，NK細(xì)胞以外的免疫效應(yīng)器也在被研究。這些細(xì)胞群擁有許多特定的生物學(xué)特征，可以顯著擴(kuò)展和多樣化基于CAR-T的治療方法。例如，恒定的NK T細(xì)胞在CAR-T療法中的潛力引起了越來(lái)越多關(guān)注，因?yàn)樗鼈?strong>同時(shí)具有天然免疫細(xì)胞和獲得性免疫細(xì)胞的特征。

類似先天免疫細(xì)胞，它們可以對(duì)抗原暴露做出快速反應(yīng)，但它們也可以適應(yīng)細(xì)胞的方式進(jìn)行精確的抗原識(shí)別。

與傳統(tǒng)T細(xì)胞不同，它們的TCR能識(shí)別CD1d呈遞的脂類抗原（CD1d是一種單態(tài)的MHC類1分子）另一組正在探索作為CAR-T潛在平臺(tái)的免疫效應(yīng)細(xì)胞是Gd T細(xì)胞。這些T細(xì)胞主要分布在上皮細(xì)胞表面，表達(dá)gdTCRs，而gdTCRs以不依賴MHC的方式(例如，由氨基二磷酸)觸發(fā)。

與ab TCR激活相反。Gd T細(xì)胞也可以交叉呈遞抗原給ab T細(xì)胞，因此可以作為先天免疫和獲得性免疫之間的紐帶。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)是一組具有混合T和NK細(xì)胞樣表型的免疫效應(yīng)細(xì)胞，因此可以通過(guò)MHC依賴和非MHC依賴的方式殺傷腫瘤靶細(xì)胞。

探索CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的CIK細(xì)胞的臨床前研究在血液學(xué)和實(shí)體瘤中都顯示出了有希望的結(jié)果，并啟動(dòng)了一項(xiàng)正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)(NCT03389035)，以測(cè)試CAR CIK-CD19細(xì)胞在成人和兒童復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病患者中的安全性。

除了淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞也能夠穿透腫瘤床并自然吞噬惡性細(xì)胞。巨噬細(xì)胞作為基于CAR的治療的可能效應(yīng)器而引起了人們的注意。表1總結(jié)了以CAR為基礎(chǔ)的癌癥治療的替代免疫效應(yīng)細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)。作為CAR平臺(tái)的這些類型的免疫細(xì)胞的臨床前評(píng)估支持這一預(yù)測(cè)(由Rotolo等人審查)，使用這些細(xì)胞類型的臨床試驗(yàn)正在計(jì)劃中(見(jiàn)表2)。

CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種RNA介導(dǎo)的細(xì)菌防御病毒(噬菌體)和質(zhì)粒的系統(tǒng)，以及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重新用于精確的RNA可編程基因組編輯的質(zhì)粒。因?yàn)楹?jiǎn)單、高效、可重復(fù)性和低成本，CRISPR的發(fā)現(xiàn)使基因編輯領(lǐng)域發(fā)生了革命性的變化。

簡(jiǎn)而言之，實(shí)驗(yàn)室中用于基因編輯的CRISPR-Cas9技術(shù)依賴于兩個(gè)關(guān)鍵要素：能充當(dāng)分子剪刀，在特定位置切割DNA的Cas9酶。和一段由兩個(gè)片段組成(反式激活的CRISPR RNA被稱為引導(dǎo)RNA的RNA，它能與Cas9酶結(jié)合，還有預(yù)先設(shè)計(jì)成識(shí)別目標(biāo)基因中的互補(bǔ)DNA靶點(diǎn)的CRISPR RNA，序列長(zhǎng)度大概為18到20個(gè)核苷酸)。

因此，引導(dǎo)RNA可以將Cas9酶引導(dǎo)到所需的靶序列以進(jìn)行基因編輯。CRISPR-Cas9工具還可以通過(guò)使用多個(gè)單引導(dǎo)RNA來(lái)同時(shí)靶向多個(gè)基因。

需要注意的是，通過(guò)使用工程核酸酶技術(shù)，例如CRISPR基因編輯，可以在非靶標(biāo)切割位點(diǎn)上進(jìn)行插入或刪除。對(duì)于臨床應(yīng)用，識(shí)別低頻變化至關(guān)重要。因此，在以CRISPR為基礎(chǔ)的療法可以轉(zhuǎn)化到臨床之前，必須通過(guò)GUIDE-Seq、 Circle-Seq、和RhampSeq等技術(shù)仔細(xì)評(píng)估非靶點(diǎn)效應(yīng)。最近已證明核糖核蛋白復(fù)合體和高保真Cas9酶的使用可以顯著減少這種不必要的DNA變化。

鑒于這種多功能的基因編輯技術(shù)，人們可以設(shè)想其在細(xì)胞治療中的潛在應(yīng)用。通過(guò)選擇性地抑制細(xì)胞溶解活動(dòng)的負(fù)面調(diào)節(jié)和增加激活信號(hào)來(lái)改變免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能是一個(gè)很好的起點(diǎn)。這項(xiàng)技術(shù)還可以通過(guò)靶向與毒性相關(guān)的基因來(lái)微調(diào)細(xì)胞治療產(chǎn)品的安全性。

Stadtmauer等人最近報(bào)道了CRISPR修飾的過(guò)繼細(xì)胞治療癌癥的積極步驟。在這項(xiàng)首創(chuàng)的人類先導(dǎo)研究中，研究人員從難治性癌癥患者的血液中分離出自體T細(xì)胞，并用針對(duì)TRAC、TRBC1和TRBC2的CRISPR-Cas9核糖核蛋白復(fù)合體電穿孔它們，以抑制內(nèi)源性TCR和PDCD1，以減少程序性細(xì)胞死亡蛋白1的表達(dá)，然后用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，表達(dá)針對(duì)腫瘤-睪丸抗原NY-ESO-1和LAGE-1的TCR，體外擴(kuò)增，然后通過(guò)靜脈輸注返回給患者。

表3.CRISPR-CAS改良細(xì)胞療法治療癌癥

這一階段的研究確立了CRISPR-Cas9介導(dǎo)的多重人類T細(xì)胞基因組工程的可行性和初步安全性。其他評(píng)估CRISPR修飾過(guò)繼細(xì)胞療法的臨床試驗(yàn)也在進(jìn)行中，如表3所示。我們團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種將CAR工程與原代NK細(xì)胞CRISPR-Cas9基因編輯相結(jié)合的方法，并正在努力開(kāi)發(fā)一種符合實(shí)踐需要的良好策略，用于生產(chǎn)現(xiàn)成的CRISPR修飾的臍帶血來(lái)源的CAR-NK細(xì)胞，用于癌癥患者治療。

CAR-T細(xì)胞治療已經(jīng)從概念發(fā)展到對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤具有巨大治療潛力的“明星”療法。盡管如此，CAR-T細(xì)胞與其他形式的癌癥治療相比有許多優(yōu)勢(shì)?；贑AR-T療法局限性目前正在引入CAR-T替代平臺(tái)，包括NK細(xì)胞，以及創(chuàng)新方法，如CRISPR-Cas9基因編輯，以對(duì)抗腫瘤啟動(dòng)的免疫抑制策略而被克服。如果這些努力成功，我們期待有一天，癌癥細(xì)胞療法的臨床應(yīng)用將成為常規(guī)，而非僅僅作為一線治療邊緣的研究策略。

參考文獻(xiàn)：

1. Basar, R., Daher, M., & Rezvani, K. (2020). Next-generation cell therapies: the emerging role of CAR-NK cells. Hematology. American Society of Hematology. Education Program, 2020(1), 570–578. https:///10.1182/hematology.2020002547