【原】【分子克隆】什么是IRES元件和2A肽(P2A/T2A/E2A/F2A)？

GCTA 2022-08-12 發(fā)布于廣東

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什么是IRES元件？

IRES元件是一段非編碼RNA，又被稱(chēng)為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（Internal ribosome entry site），能招募核糖體對(duì)mRNA進(jìn)行翻譯。

實(shí)驗(yàn)證明，將IRES與外源cDNA融合，發(fā)現(xiàn)IRES能獨(dú)立地起始翻譯。(IRES可以直接連接ATG起始密碼子)。

一般情況下，真核mRNA的翻譯都需要5'帽子來(lái)介導(dǎo)核糖體結(jié)合，Eif4e首先結(jié)合到5'帽子結(jié)構(gòu)，然后形成翻譯起始復(fù)合物啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯，但真核生物和病毒中還存在一些例外情況，例如一些基因5'端具有一段較短的RNA序列（約150-250BP），這類(lèi)RNA序列能折疊成類(lèi)似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)核糖體與RNA結(jié)合，起始蛋白質(zhì)翻譯。

核糖體活性結(jié)合位點(diǎn)與mRNA翻譯過(guò)程

翻譯起始復(fù)合物（translation initiation complex）：由核糖體亞基，一個(gè)mRNA模板，一個(gè)起始的tRNA分子和起始因子組成并組裝在蛋白質(zhì)合成起始點(diǎn)的復(fù)合物。

最常用的IRES元件來(lái)源于腦心肌炎病毒（EMCV），作為額外的核糖體募集位點(diǎn)起作用，允許翻譯起始發(fā)生在除了翻譯起始位點(diǎn)之外的mRNA內(nèi)部區(qū)域。使用單個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)多個(gè)ORF的表達(dá)時(shí)，可以選擇將多個(gè)ORF置于啟動(dòng)子后面，通過(guò)連接子（linkers）如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）或2A肽將每個(gè)ORF分隔開(kāi)，單個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄物將會(huì)產(chǎn)生多個(gè)蛋白。

IRES元件序列：cccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataA

提問(wèn)：Intron最后的命運(yùn)會(huì)怎樣?會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)出核嗎？何時(shí)何地被降解？

什么是2A肽？

2A肽是來(lái)源于病毒的短肽（一般為18~25個(gè)氨基酸），通常被稱(chēng)為“自我剪切”肽。

2A肽能使一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生多種蛋白。

2A肽并不是完全的“自我剪切”，而是通過(guò)使核糖體跳過(guò)2A元件C-末端的甘氨酸和脯氨酸肽鍵的合成而發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致2A序列末端和下游產(chǎn)物分離。

“Eukaryotic ribosomes fail to insert a peptide bond between the Gly and Pro residues, yielding separate polypeptides.”

其中，上游蛋白的C端將會(huì)添加一些額外的2A殘基，而下游蛋白的N端將會(huì)有額外的脯氨酸。

目前有四種常用的2A肽，分別是P2A，T2A，E2A和F2A，來(lái)源于四種不同的病毒。

P2A肽的核酸序列可以根據(jù)需求來(lái)改變，但是其蛋白質(zhì)序列一般是固定的。其中一個(gè)例子如下：

P2A肽序列：gcaacaaacttctctctgctgaaacaagccggagatgtcgaagagaatcctggaccg

兩種連接子（linkers）的優(yōu)缺點(diǎn)比較

和2A肽相比，IRES的好處在于它不影響上下游ORF的蛋白序列，可以獨(dú)立啟動(dòng)翻譯。

IRES的缺點(diǎn)是下游ORF的表達(dá)水平比較低（為上游ORF表達(dá)水平的10%-20%）。因?yàn)楹颂求w從內(nèi)部插入的效率不如翻譯起始復(fù)合物組裝的效率，所以在IRES后表達(dá)熒光蛋白（EGFP）時(shí)，難以獲得可檢測(cè)的熒光信號(hào)，這就導(dǎo)致IRES難以在體內(nèi)應(yīng)用。此外，IRES元件的大?。?gt;500 bp）也可能會(huì)增加載體構(gòu)建和病毒包裝的難度。

2A肽下游ORF的表達(dá)水平與上游ORF相當(dāng)，這是IRES元件所不能比擬的。

但是，2A肽的缺點(diǎn)是它可能會(huì)在上下游ORF留下附加殘基，從而產(chǎn)生潛在的不良影響。但是對(duì)于比較大的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)其影響可以忽略不計(jì)，很多研究都會(huì)在過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)的N端或者C端加入一個(gè)甚至三個(gè)Flag序列（gactacaaggacgacgatgacaag）。

如果不需要第二個(gè)ORF的高水平表達(dá)（如藥物篩選標(biāo)記），那么IRES應(yīng)該是可以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求的。

然而，如果多順?lè)醋又写嬖趦蓚€(gè)以上的ORF，或者等量共表達(dá)多個(gè)ORF很重要，這時(shí)就需要使用2A肽。

在四種常用的2A肽（P2A，T2A，E2A和F2A）中，P2A通常具有最高的切割效率（接近100％），接下來(lái)是T2A，其次是E2A和F2A。F2A的切割效率僅為約50％。

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溫馨提示:

2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效率會(huì)受上下游ORF序列的影響。因此，不能進(jìn)行有效自我切割的融合蛋白將會(huì)是一種翻譯產(chǎn)物，在某些實(shí)驗(yàn)運(yùn)用中，這是一個(gè)值得注意的問(wèn)題。我們?cè)跇?gòu)建載體的時(shí)候，特別需要注意的是IRES前一個(gè)ORF有終止密碼子，2A肽前一個(gè)ORF的終止密碼子需要?jiǎng)h除。