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1984年，HUVEC細胞株由Hiroyoshi Hoshi、Wallace L.Mckeehan從一段長約10-20cm的人正常臍帶靜脈中獲取、建立。 SetsukoShioda等人研究發(fā)現(xiàn)，HUVEC細胞株18-30代的倍增時間為23.5個小時，24-27代的倍增時間為67個小時，27-30代的倍增時間為84個小時，32-34代的倍增時間為100個小時。培養(yǎng)至40代后，細胞形態(tài)出現(xiàn)多樣化，有些細胞變大或變小，有些細胞出現(xiàn)多核；細胞密度下降、倍增時間延長。最后細胞在第54代停止生長，ATCC的預(yù)期壽命也顯示在50-60代。2018年，Setsuko Shioda等人發(fā)現(xiàn)HUVEC細胞株（passage 31）在貼壁匯合時細胞與細胞之間存在間隙，這與典型的內(nèi)皮細胞特征有所不同。
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm器皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。60%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+30%FBS+10%DMSO，液氮儲存【推薦海星HyCyte?一步凍存液(即用型、無血清、無需程序降溫)】1. 待細胞生長至可傳代的密度，即可準(zhǔn)備凍存。 2. 消化細胞，取少量細胞懸液計數(shù)。細胞懸液經(jīng)250 g離心4 min。 3. 離心后去除上清，用適量4℃預(yù)冷的凍存液重懸細胞。將細胞按比例或數(shù)量分裝至凍存管中。一般凍存密度為(1.0~2.0)×106個/mL。 注意: 細胞長時間在非培養(yǎng)條件下放置會嚴(yán)重影響細胞的狀態(tài)。如離心后用凍存液重懸計數(shù)，請將細胞放置于4℃冰箱內(nèi)，以減弱細胞代謝，較好的保持細胞狀態(tài)。 4. 如使用海星一步凍存液，凍存管直接豎直放入-80℃冰箱即可完成“一步”凍存。如使用程序凍存液，需將凍存管放入提前預(yù)冷的程序降溫盒后放入-80℃冰箱。5. 24小時后可將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮進行長期保存。 注意: 細胞不可長期保存在-80℃冰箱中。建議24 h后盡快轉(zhuǎn)移至液氮中。培養(yǎng)基：內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋5% FBS＋1%內(nèi)皮細胞培養(yǎng)添加劑+1% P/S 推薦傳代比例：1:3-1:4，每2-3天換液一次 培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%CO?，溫度：37℃ 細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。 1. 預(yù)熱完全培養(yǎng)基、胰酶、PBS2. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。3. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA 貨號: GUTP-R001）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。4. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。5. 將細胞懸液按1：2到1：4的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
1. 該細胞為有限傳代細胞系，在體外培養(yǎng)可傳20代。請注意代次控制。2. 該細胞培養(yǎng)難度較高，建議使用專用培養(yǎng)基。3. 永生化的人臍靜脈內(nèi)皮培養(yǎng)體系：內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋5% FBS＋1%內(nèi)皮細胞培養(yǎng)添加劑+1% P/S。推薦使用海星人臍靜脈內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)基，貨號：TCH-G406。4. 如選擇使用其它品牌培養(yǎng)基，可選：（1）內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基推薦：ScienCell（Cat.No.1001）基本成分介紹：永生化的人臍靜脈內(nèi)皮培養(yǎng)體系是專門為血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)設(shè)計的最適于其生長的完全培養(yǎng)基。包含必需和非必需氨基酸、維生素、有機和無機化合物、激素、生長因子、微量礦物質(zhì)和低濃度胎牛血清(5%)。該培養(yǎng)基的配方能夠選擇性的促進正常血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)中的增殖和生長，并為其達到最理想營養(yǎng)平衡狀態(tài)。（2）胎牛血清推薦：HyCyte?干細胞預(yù)篩選胎牛血清 （Cat.No.FBP-S001）基本成分介紹：適用于有較高要求的細胞和較難獲得的細胞，如血管內(nèi)皮細胞。
（3）內(nèi)皮細胞培養(yǎng)添加劑推薦：ScienCell（Cat.No.SC1052)基本成分介紹：內(nèi)皮細胞培養(yǎng)添加劑(ECGS)是一種從牛腦垂體提取的培養(yǎng)基補充劑，含有培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞所必需的生長因子、激素和蛋白質(zhì)。該補充劑最大限度地促進永生化的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的生長，該因子的添加對維持永生化的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）形態(tài)至關(guān)重要。
注 意 | | （1）請務(wù)必使用以上兩種推薦培養(yǎng)體系進行永生化的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的培養(yǎng)，否則可能導(dǎo)致細胞無法增殖。（2）T25瓶細胞由于運輸過程影響細胞會分泌產(chǎn)生的少量小黑點，不是污染問題，屬正?，F(xiàn)象，使用專用培養(yǎng)體系進行培養(yǎng)后黑點會逐步減少。（3）永生化的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）對血清的品質(zhì)要求較高，請使用高品質(zhì)胎牛血清進行培養(yǎng)。如細胞狀態(tài)欠佳，建議將胎牛血清的濃度提高到10%。 |
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