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按照GMP和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)胞的高水平生產(chǎn)，需要一個(gè)完全封閉、可控制和可擴(kuò)展的培養(yǎng)系統(tǒng)[1]?；谏锓磻?yīng)器的細(xì)胞擴(kuò)展?jié)M足這些要求。生物反應(yīng)器可以被定義為一個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)，其中對(duì)培養(yǎng)變量（如pH、溫度、氧氣和二氧化碳濃度）進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋O(jiān)控和控制，以維持細(xì)胞的均勻物理化學(xué)環(huán)境，并在需要時(shí)提供粘附表面以支持細(xì)胞粘附（例如加入微載體）。雖然MSC可以在培養(yǎng)中擴(kuò)增超過40個(gè)分裂周期（群體倍增，PD），但已經(jīng)有專家建議最好是少于20個(gè)PD，尤其是是骨髓MSC，以避免可能的細(xì)胞轉(zhuǎn)化[2, 3]。整個(gè)MSC規(guī)?；囵B(yǎng)體系，核心在于培養(yǎng)基和培養(yǎng)模式的選擇。培養(yǎng)模式還需要考慮MSC大規(guī)模擴(kuò)增后的回收操作是否便利和符合GMP/GTP要求。 1，MSC培養(yǎng)基 大規(guī)模體外培養(yǎng)擴(kuò)增高質(zhì)量的MSC，是干細(xì)胞企業(yè)所追求的。那么建立合適的培養(yǎng)體系就顯得非常重要，而培養(yǎng)基是重中之重。本公眾號(hào)的文章《干細(xì)胞行業(yè)的葵花寶典：MSC的培養(yǎng)方法總匯》在MSC培養(yǎng)方面有專業(yè)詳細(xì)的闡述。本部分內(nèi)容有部分的重復(fù)和新的補(bǔ)充。（1）人源化培養(yǎng)基 用于分離和擴(kuò)增MSC的常規(guī)培養(yǎng)基通常是確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM添加10%-20%的胎牛血清（FBS）。然而，對(duì)于臨床使用的FBS存在擔(dān)憂：即（1）不同批次的FBS的可變性，（2）其定義不明確的性質(zhì)，以及（3）FBS含有有害污染物的可能性，如朊病毒、病毒和人畜共患病試劑。當(dāng)人類MSC在含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，這些蛋白中的相當(dāng)一部分保留在人類MSC的細(xì)胞質(zhì)中，這可能在細(xì)胞移植到體內(nèi)時(shí)引發(fā)免疫反應(yīng)[4]。更多的可能情況是胎牛血清沒洗滌干凈，在MSC注射液中存在，從而進(jìn)入人體引起免疫反應(yīng)。正因?yàn)槿绱?，盡管FBS仍然廣泛用于MSC研究，但成份清晰確定的無血清培養(yǎng)基，將是未來的發(fā)展方向。大多數(shù)MSC培養(yǎng)通常使用胎牛血清（FBS）作為培養(yǎng)基的補(bǔ)充。然而，為了避免傳播異種傳染病和免疫的風(fēng)險(xiǎn)，F(xiàn)BS的替代品有人血清、富血小板血漿和血小板裂解物（HPL）。人血清和血小板衍生物可以作為FBS的合適替代品用于培養(yǎng)人各個(gè)組織來源的MSC[5-10]。盡管已有報(bào)道稱人類自體血清支持MSC擴(kuò)增，同一個(gè)個(gè)體來源的血清，很難獲得足夠數(shù)量的這種血清來產(chǎn)生臨床相關(guān)數(shù)量的MSC。同種異體人AB血清將繞過這個(gè)問題，因?yàn)閹讉€(gè)捐贈(zèng)者血清可以匯集在一起，以消除捐贈(zèng)者特異性差異，并以大規(guī)模的方式生產(chǎn)[11]。人血小板裂解物（HPL）或富含血小板的血漿對(duì)MSC具有相當(dāng)大的促進(jìn)生長(zhǎng)特性，同時(shí)保持其分化潛能和免疫調(diào)節(jié)特性[7, 8]。然而，一項(xiàng)研究報(bào)告稱，盡管HPL支持MSC的擴(kuò)增，但它也損害了其免疫調(diào)節(jié)能力[12]。此外，在HPL擴(kuò)增的MSC中觀察到成骨或成脂分化潛能的降低[13, 14]。理論上，人血清和血小板裂解液并不比FBS安全，因?yàn)槿匀淮嬖谥怀Ｒ?guī)獻(xiàn)血者篩查未檢測(cè)到的人體病原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，人血清和血小板裂解液的生產(chǎn)制備的批次間的差異很大，它們維持MSC生長(zhǎng)和治療潛力的能力可能存在很大的差異，這可能會(huì)阻礙有質(zhì)量保證的MSC用于大型臨床研究的發(fā)展。因此，應(yīng)努力使這些材料的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，限制供體與供體之間的可變性，在注重檢測(cè)的基礎(chǔ)上建立病原體滅活方法[15, 16]。需要注意的是，血小板裂解液在培養(yǎng)MSC的安全性和有效性方面并不一定優(yōu)于胎牛血清，詳情請(qǐng)見本公眾號(hào)文章《血小板裂解物真的能代替胎牛血清？》（2）定義清晰的無血清培養(yǎng)基 化學(xué)成份清晰的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行MSC擴(kuò)增[17, 18]，有利于減少人源和動(dòng)物源的病原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。有兩種商業(yè)無血清培養(yǎng)基被證明支持MSC的分離和擴(kuò)增，Mesencult-XF和BD Mosaic?。Mesencult-XF來源于加拿大的Stemcell Technologies公司，BD Mosaic?來源于美國(guó)BD公司。FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)商業(yè)無異種培養(yǎng)基是StemPro MSC-SFM（Invitgen）[19, 20]。在傳代早期，脂肪MSC和骨髓MSC在MesenCult-XF中顯示出比α-MEM（含血清）更好的增殖；然而，在MesenCult-XF中CFU明顯較低，而且骨髓MSC在MesenCult-XF傳代后期出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，伴隨著快速衰老（β-半乳糖苷酶活性增強(qiáng)）[21]。同樣，早期GE-Healthcare公司開發(fā)的無血清培養(yǎng)基Xuri在促進(jìn)骨髓MSC增殖和CFU-F克隆方面不如α-MEM（含血清）培養(yǎng)基[22]。脂肪MSC在STK2（一種化學(xué)定義的培養(yǎng)基，韓國(guó)Abion公司）中的增殖率明顯高于在DMEM/FBS中的增殖率，在STK2中培養(yǎng)的MSC衰老速率降低，細(xì)胞體積小而均勻，并且遺傳穩(wěn)定性更高，與增殖/遷移、抗炎和分化相關(guān)的因子的表達(dá)增加[18]。無動(dòng)物源和無血清的NutriStem培養(yǎng)基（以色列的Biological Industries公司），培養(yǎng)脂肪MSC，在第7天時(shí)，MSC分泌的HGF和Angpt-1高于單純用低糖DMEM培養(yǎng)的MSC，但是VEGF和PEDF的分泌不如低糖DMEM培養(yǎng)的MSC[23]。從人骨髓、臍帶、牙髓和脂肪中分離和培養(yǎng)的MSC經(jīng)過ABCell生物公司的無血清培養(yǎng)基SPE-IV培養(yǎng)，不同來源的MSC在活性、CFU-F克隆形成和增殖方面沒有差別[24]。牙髓來源的MSC在三種不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即StemPro-MSC/SFM-xenoFree（Life Technologies）、StemMacs-MSC/XF（Miltenyi Biotek），以及α-MEM完全培養(yǎng)基（Life Technologies）（含15%胎牛血清），α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)牙髓MSC至P6-7代時(shí)，衰老的MSC（SA-β-Gal陽(yáng)性）約10%，而無血清培養(yǎng)基StemMacs和StemPro培養(yǎng)的衰老MSC分別為30%和20%[25]。和含血清的完全培養(yǎng)基相比，無血清培養(yǎng)基PRIME-XV?（美國(guó)Irvine Scientific公司）培養(yǎng)的MSC的抗凋亡能力很差，對(duì)H2O2和紫外線的細(xì)胞毒性刺激更敏感[26]。目前的無血清培養(yǎng)可以做到低代數(shù)的情況實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)MSC。無血清培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)了MSC在數(shù)量上的大規(guī)模擴(kuò)增，但是伴隨著快速衰老和細(xì)胞質(zhì)量的下降。MSC臨床應(yīng)用治療疾病，不僅要強(qiáng)度MSC的劑量，而且還要重視MSC的質(zhì)量?；瘜W(xué)成份清晰明確的SF/XF培養(yǎng)基配方可能代表MSC的臨床級(jí)生產(chǎn)的未來，但是，本小編認(rèn)為血清或血小板裂解液依然是不可替代的。詳情請(qǐng)見本公眾號(hào)文章《MSC的無血清培養(yǎng)是趨勢(shì)，但不是現(xiàn)在》。2，培養(yǎng)模式 （1）平面貼壁和球形培養(yǎng) MSC的貼壁培養(yǎng)可能改變其表型和治療特性，因?yàn)樗淼沫h(huán)境與它們?cè)隗w內(nèi)的小生境不同[27]。事實(shí)上，用生物因素或培養(yǎng)條件預(yù)處理MSC可以增強(qiáng)MSC的治療功效[28-31]。一種方法是將MSC培養(yǎng)為球體[27]。MSC的聚集增強(qiáng)了它們的抗炎特性，即TSG-6和stanniocalcin-1的表達(dá)增加[32]。球體培養(yǎng)表達(dá)高水平的三種抗癌蛋白：白細(xì)胞介素-24，腫瘤壞死因子α相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體和CD82[32]。MSC聚集體的形成不僅可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗炎特性，并且經(jīng)過腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ處理的MSC，它們抑制巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α的能力得到增強(qiáng)[33]。（2）常氧和低氧培養(yǎng) MSC的體外擴(kuò)增通常是在正常的氧氣（21%）水平下進(jìn)行的。據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)期暴露于這些水平的MSC會(huì)導(dǎo)致DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞衰老和治療效果降低[34]。當(dāng)在生理氧氣水平（1-5%）培養(yǎng)MSC時(shí)，觀察到細(xì)胞增殖速度以及其成脂和成骨分化能力的增加[35]。在低氧條件下擴(kuò)增的MSC具有較低水平的氧化應(yīng)激、DNA損傷、端?？s短和染色體異常[34]，而且因遷移能力增強(qiáng)和生存能力提高而具有較高的治療能力[36-38]。為了模擬缺血的微環(huán)境，將用血清培養(yǎng)的MSC置于缺氧條件下的無血清培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)其分泌的促血管生成因子水平增加，包括VEGF-A、血管生成素、IGF-1和HGF[39]。因此，鑒于這些觀察結(jié)果，可能有必要考慮在體內(nèi)移植細(xì)胞之前在缺氧條件下擴(kuò)增MSC，以提高其存活率和治療潛力。（3）微載體的選擇 微載體通常是在材料、密度、直徑和表面電荷方面不同的球形珠子。選擇合適的微載體是MSC培養(yǎng)擴(kuò)增過程的關(guān)鍵變量，因?yàn)樗梢杂绊懮L(zhǎng)動(dòng)力學(xué)以及擴(kuò)增細(xì)胞的表型。微載體可以具有不同的表面性質(zhì)和涂層，從而影響細(xì)胞附著和隨后的細(xì)胞增殖。理想的微載體不僅應(yīng)該能夠支持有效的細(xì)胞附著和生長(zhǎng)，而且應(yīng)該能夠在不損失MSC特性的情況下允許容易的細(xì)胞收獲操作。一般而言，微載體表面覆蓋膠原涂層，有利于MSC的細(xì)胞粘附和增殖。大孔和可生物降解的微載體已經(jīng)被評(píng)估用于MSC的生長(zhǎng)[40-42]。選擇特定的最佳微載體的一種有趣的方法是使用能夠評(píng)估單個(gè)微載體的性能并基于特定培養(yǎng)參數(shù)(細(xì)胞生長(zhǎng)、群體倍增、收獲效率)進(jìn)行比較的小規(guī)模系統(tǒng)[43]。理想情況下，在經(jīng)過至少3個(gè)重復(fù)的嚴(yán)格篩選方案后，可以圍繞特定的微載體建立一個(gè)生產(chǎn)體系[44]。這些微載體允許細(xì)胞在微載體內(nèi)部生長(zhǎng)，不受攪拌生物反應(yīng)器中存在的流體動(dòng)力剪切的影響。通過使用可生物降解的微載體，MSC回收率可能更高。MSC甚至可以和微載體在體內(nèi)局部移植而無需分離[45]。正如在無動(dòng)物源血清培養(yǎng)基一樣，無動(dòng)物組分的微載體的使用也很重要。有些研究已經(jīng)證明無動(dòng)物成份的微載體能很好地支持人MSC的生長(zhǎng)[20, 46, 47]。微載體密度和細(xì)胞數(shù)量比是眾所周知的變量，不僅影響初始細(xì)胞附著效率，而且還影響細(xì)胞培養(yǎng)的密度水平。常用的微載體密度為2g/L，可以獲得MSC的濃度在(1-4)×105細(xì)胞/毫升的范圍[20, 40, 47]。在MSC增殖擴(kuò)增的后期，需要注意添加足夠的新鮮培養(yǎng)以補(bǔ)充細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)。（4）大規(guī)模培養(yǎng) 單層培養(yǎng)即平面二維培養(yǎng)是傳統(tǒng)的和廣泛使用的MSC實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)于小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)需求來說，具有成本低和易于處理的優(yōu)勢(shì)。在這個(gè)基礎(chǔ)上，一個(gè)大的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放置多層培養(yǎng)平面，即形成多層細(xì)胞工廠，Nunc和Corning公司都有商業(yè)提供。該培養(yǎng)系統(tǒng)旨在通過增加單個(gè)堆疊單元（培養(yǎng)平面）的數(shù)量來為細(xì)胞生長(zhǎng)提供較大的表面。據(jù)報(bào)道10層的細(xì)胞工廠容器中可以實(shí)現(xiàn)(0.45-2.5)×108的MSC細(xì)胞的生產(chǎn)[9]。4個(gè)10層這樣的細(xì)胞工廠，可獲得10億個(gè)MSC細(xì)胞，但是需要一個(gè)自動(dòng)化細(xì)胞工廠操縱器（automated cell factory manipulator，ACFM）和一個(gè)大的培養(yǎng)箱[48]。盡管在促進(jìn)MSC培養(yǎng)擴(kuò)增方面有效，但單層培養(yǎng)技術(shù)有許多限制，包括連續(xù)傳代的酶處理而可能干擾細(xì)胞功能特性的過度操作，以及由于頻繁操作而導(dǎo)致更高的污染風(fēng)險(xiǎn)，缺乏對(duì)培養(yǎng)參數(shù)和細(xì)胞生理學(xué)的控制，用于產(chǎn)生足夠數(shù)量的細(xì)胞需要長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)。大量證據(jù)表明，單層平面（2D系統(tǒng)）培養(yǎng)損害了MSC的效力，而立體式（3D培養(yǎng)）培養(yǎng)可以通過增強(qiáng)MSC的抗炎能力、促血管生成能力、MSC的干性和存活率來增加MSC的治療潛力[49, 50]。此外，單層培養(yǎng)瓶被認(rèn)為是“開放系統(tǒng)”，因?yàn)樗鼈兊慕臃N、培養(yǎng)基交換和細(xì)胞收獲是通過操作員直接操作[51]。自動(dòng)化和機(jī)器人技術(shù)可以最大限度地減少上面列出的缺點(diǎn)[52]。實(shí)驗(yàn)室中使用最廣泛的生物反應(yīng)器是組織培養(yǎng)瓶。然而，臨床應(yīng)用中需要大量的MSC，那在生產(chǎn)過程中將需要大量的組織培養(yǎng)瓶。處理大量的這些培養(yǎng)瓶是非常勞動(dòng)密集型的，增加細(xì)菌污染的機(jī)會(huì)，而且往往會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)瓶之間的差異?？紤]到MSC的應(yīng)用需要一定量的劑量，有可能需要在生物反應(yīng)器系統(tǒng)（培養(yǎng)擴(kuò)增）中產(chǎn)生大量細(xì)胞，并創(chuàng)建一個(gè)強(qiáng)大的細(xì)胞庫(kù)來為所有療法提供MSC細(xì)胞[53]。因此，為了給臨床提供大量的MSC，可以采用大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，包括多層細(xì)胞工廠、滾筒瓶、中空纖維、填料床和攪拌懸浮生物反應(yīng)器等。每個(gè)生物反應(yīng)器都有其特定的特點(diǎn)，比較不同的生物反應(yīng)器并選擇最佳的生物反應(yīng)器對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)有質(zhì)量保證的MSC非常重要。比如，滾筒瓶已用于MSC組織工程應(yīng)用和擴(kuò)展[54]。雖然滾筒瓶代表著一個(gè)開放的系統(tǒng)和密集的勞動(dòng)力，但與傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶相比，它提供了更大的表面積，并降低了對(duì)培養(yǎng)基的要求[1]。盡管該系統(tǒng)與靜態(tài)培養(yǎng)瓶相比具有優(yōu)勢(shì)，但也有實(shí)驗(yàn)室利用滾筒瓶培養(yǎng)臍帶MSC，即使優(yōu)化不同的培養(yǎng)條件，使用滾筒瓶依然無法實(shí)現(xiàn)令人滿意的MSC培養(yǎng)擴(kuò)增[9]。關(guān)于立體式大規(guī)模培養(yǎng)的闡述和信息，請(qǐng)參見本公眾號(hào)的文章《漸行漸近的MSC的3D培養(yǎng)》。3，培養(yǎng)的MSC的收獲 MSC下游處理（DSP）涉及幾個(gè)復(fù)雜的步驟，在細(xì)胞從支架或者微載體分離后，離心濃縮體積減小，多次細(xì)胞洗滌，以及低溫保存。為了獲得具有足夠數(shù)量和功能的高純細(xì)胞產(chǎn)品，整個(gè)DSP工藝必須滿足特定要求，包括縮短處理時(shí)間、大量減少體積、高效洗滌（將雜質(zhì)水平降低到<1ppm）、低剪切應(yīng)力條件，整個(gè)系統(tǒng)還需要在GMP標(biāo)準(zhǔn)下封閉、自動(dòng)化和可擴(kuò)展性[55]。在基于微載體的培養(yǎng)中，收獲細(xì)胞過程是一個(gè)必不可少的步驟，因?yàn)榧?xì)胞將是最終產(chǎn)物。通常，與細(xì)胞粘附一起的微載體可以用蛋白水解酶處理，然后通過過濾分離細(xì)胞與微載體。胰蛋白酶、Tryple?、Accutase?、Alfazyme、Collagenase和TrypZean?是可用于從微載體分離MSC的酶。整個(gè)細(xì)胞收獲的過程受多種變量的影響，包括酶類型和培養(yǎng)參數(shù)（濃度，溫度和持續(xù)時(shí)間），靜態(tài)系統(tǒng)和動(dòng)態(tài)系統(tǒng)（攪拌系統(tǒng)的剪切力在脫離后降低細(xì)胞活力），以及細(xì)胞恢復(fù)后的下游過程（額外的步驟也會(huì)降低細(xì)胞活力）[56]。有實(shí)驗(yàn)室建議在適當(dāng)?shù)拿福ㄒ鹊鞍酌福┐嬖谙露虝r(shí)間（7分鐘）的強(qiáng)烈攪拌，MSC收獲效率>95%；而且只需微調(diào)酶濃度和攪拌/時(shí)間，即可用于不同的細(xì)胞系和微載體[57]。事實(shí)上，大多數(shù)發(fā)表的文章都沒有提到MSC的收獲效率。孔徑大于75μm的聚丙烯過濾器可以提供有效的微載體去除，孔徑大于0.45μm（中空纖維盒）的聚砜膜能夠?qū)⒓?xì)胞濃縮到10倍（存活率>80%）[58]。使用負(fù)模膨脹床吸附（EBA）層析和基于核殼微珠技術(shù)的新型多模態(tài)原型基質(zhì)，改進(jìn)洗滌步驟，色譜步驟實(shí)現(xiàn)了單程操作，使活性和功能性MSC的回收率提高10倍以上，達(dá)到70%[59]。在濃縮和洗滌步驟之后，然后使用特定的低溫保存緩沖液來低溫凍存MSC細(xì)胞?？梢允褂米詣?dòng)化系統(tǒng)（如Crystal?PX）進(jìn)行大規(guī)模的小瓶灌裝，并且每批還需要控制速率冰柜來處理數(shù)千個(gè)小瓶，使細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量得以保持[55]。4，小結(jié) 每個(gè)干細(xì)胞公司/企業(yè)的MSC整個(gè)培養(yǎng)（生產(chǎn)）體系，都應(yīng)該經(jīng)過QbD（質(zhì)量源于設(shè)計(jì)）設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，做好細(xì)胞產(chǎn)品的CMC（Chemical Manufacturing and Control），才符合干細(xì)胞藥品申報(bào)的規(guī)范要求。當(dāng)然，每家干細(xì)胞公司/企業(yè)都有自己獨(dú)特的細(xì)胞生產(chǎn)工藝的細(xì)節(jié)，只要終端產(chǎn)品（MSC注射液）符合國(guó)家的相關(guān)管理規(guī)定即可。需要注意的是，MSC的整個(gè)培養(yǎng)過程中，質(zhì)量控制需要貫穿在整個(gè)工藝中，包括樣本的采集和最后的注射液產(chǎn)品，檢測(cè)重點(diǎn)詳見本公眾號(hào)的文章《間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的安全性分析和質(zhì)控要點(diǎn)》。
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