NK細(xì)胞通過直接識(shí)別靶細(xì)胞、釋放穿孔素、NK細(xì)胞毒因子、TNF-α/β等殺傷因子殺傷靶細(xì)胞。 

K562細(xì)胞是人白血病細(xì)胞系，其HLAⅠ型表達(dá)降低，而活化的NK細(xì)胞受體配體表達(dá)增高，使其特別易受NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用的影響。將NK細(xì)胞與靶細(xì)胞（通常是K562細(xì)胞）共培養(yǎng)，然后通過檢測(cè)靶細(xì)胞釋放的酶或者用CAM、CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞，通過檢測(cè)熒光，從而得出NK細(xì)胞的殺傷活性。

幾種檢測(cè)方法比如下：

一. 主要材料和試劑

二. NK細(xì)胞殺傷

2.1 LDH釋放檢測(cè)殺傷

2.1.1乳酸脫氫酶 (LDH) 檢測(cè)殺傷原理

乳酸脫氫酶 (LDH) 是活細(xì)胞胞漿內(nèi)含酶之一。正常情況下，LDH不能透過細(xì)胞膜。當(dāng)靶細(xì)胞受到效應(yīng)細(xì)胞的攻擊而損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性改變，LDH釋放至培養(yǎng)基中。釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶Ⅰ(NAD⁺) 變成還原型輔酶Ⅰ(NADH)。后者再通過黃遞酶還原硝基氯化四氮唑藍(lán)(INT)，形成有色的甲臢類化合物，在490nm處有一高吸收峰。利用讀取的A值，經(jīng)過計(jì)算即可得知NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的活性。甲臢的形成水平與釋放到培養(yǎng)基中的LDH的數(shù)量成正比。

圖1  LDH釋放檢測(cè)細(xì)胞殺傷活性原理

2.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1. 調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞（NK細(xì)胞）密度至4.0×10⁶ /mL、靶細(xì)胞（K562細(xì)胞）密度至1.0×10⁵ /mL 。

2. 取96孔圓底培養(yǎng)板，每個(gè)樣本做3次重復(fù)，按效靶比40：1、20：1、10：1加入效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞，每孔體積為100 μL。設(shè)置與實(shí)驗(yàn)孔相同數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞自然釋放對(duì)照孔，加培養(yǎng)基使每孔終體積為100 μL。設(shè)置與實(shí)驗(yàn)孔相同數(shù)量的靶細(xì)胞最大釋放對(duì)照孔，加培養(yǎng)基使每孔終體積為90 μL（步驟4加10 μL裂解液）。設(shè)置與實(shí)驗(yàn)孔相同數(shù)量的靶細(xì)胞自然釋放對(duì)照孔，加培養(yǎng)基使每孔終體積為100 μL。設(shè)本底（每孔100 μL NK細(xì)胞培養(yǎng)基）和體積糾正孔（每孔90 μL NK細(xì)胞培養(yǎng)基+10 μL 裂解液（步驟4加入））。

3. 在效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔中加入10 μL無(wú)菌、超純水。

 圖 2  96孔板NK殺傷實(shí)驗(yàn)示意圖

4. 將培養(yǎng)板放于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。

5. 在最大孔和體積糾正孔中加入10 μL裂解緩沖液，孵育45分鐘。

6. 250 x g 離心3分鐘，每孔吸出50 μL上清液于相應(yīng)平底培養(yǎng)板，避光加入50 μL反應(yīng)底物，室溫（15-25℃）避光30分鐘，待各孔液體顏色轉(zhuǎn)深時(shí)每孔加入50 μL終止液，輕拍培養(yǎng)板混勻。。

7. 將96孔板置于酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm和680 nm波長(zhǎng)處的吸光值。為了確定LDH活性，應(yīng)從490 nm處的吸光值中減去680 nm(來自儀器的背景信號(hào))的吸光值（D）。

8. 為了計(jì)算準(zhǔn)確，應(yīng)該從實(shí)驗(yàn)平均值，效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放LDH對(duì)照值和靶細(xì)胞自發(fā)釋放LDH對(duì)照值中減去本底對(duì)照平均值。體積糾正孔對(duì)照值應(yīng)從靶細(xì)胞最大體積LDH釋放對(duì)照中去除。

9. 用下列公式，計(jì)算每組E:T殺傷率%。

NK殺傷率（%）=（實(shí)驗(yàn)D值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔D值-靶細(xì)胞自然釋放孔D值/（靶細(xì)胞裂解釋放孔D值-靶細(xì)胞自然釋放孔D值）×100%.

2.2 CCK8檢測(cè)殺傷

2.2.1 CCK8檢測(cè)殺傷原理

Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲臜的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。該方法通常作為MTT法的替代方法。

 圖4  CCK8檢測(cè)殺傷原理

2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1. K562細(xì)胞傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞備用。用NK細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)為1×10⁵ /mL。

2. 培養(yǎng)后的NK細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶ /mL、 5×10⁵ /mL、1×10⁵/mL。

3. 將效靶比=10:1、5:1、1:1的NK細(xì)胞（效）、 K562細(xì)胞（靶）加入96孔圓底板,，實(shí)驗(yàn)組分別加入各效靶比的效、靶細(xì)胞 各50 μL/孔，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞孔（50 μL細(xì)胞懸液+50 μL培養(yǎng)基）及效應(yīng)細(xì)胞（50 μL細(xì)胞懸液+50 μL培養(yǎng)基）孔作為對(duì)照孔。另加空白對(duì)照孔（NK細(xì)胞培養(yǎng)基100 μL / 孔），1孔。

圖5  CCK8檢測(cè)96孔板殺傷示意圖

4.  震蕩混勻，37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱孵育12小時(shí)。

5.  每孔加入10 μL CCK8 (5 mg/ml)，充分震蕩混勻，37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4小時(shí)。

6.  用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)OD值。按下述公式計(jì)算殺傷率:

NK殺傷率( %)=［1－(效靶細(xì)胞孔OD值－效應(yīng)細(xì)胞孔OD值) / 靶細(xì)胞孔D值］×100%

2.3 MTT檢測(cè)殺傷

2.3.1 MTT檢測(cè)殺傷原理

四甲基偶氮唑鹽 (MTT) 是一種黃色的染料?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時(shí)在細(xì)胞色素C的作用下，將淡黃色的MTT還原成藍(lán)紫色、不溶于水的甲臜顆粒。該顆粒溶解后，其液體的吸光度OD值與活細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞代謝活性呈正相關(guān)。因此吸光度OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目。由于死細(xì)胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入MTT 不會(huì)產(chǎn)生甲臜。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.  K562細(xì)胞傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞備用,用NK細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)為1×10⁵ /mL。

2.  培養(yǎng)后的NK細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁶ /mL、2.5×10⁶ /mL。

3.  將效靶比=50:1、25:1的NK細(xì)胞（效）、 K562細(xì)胞（靶）加入96孔圓底板, 實(shí)驗(yàn)組分別加入各效靶比的效、靶細(xì)胞各50 μL/孔，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞孔及效應(yīng)細(xì)胞孔作為對(duì)照孔。另加儀器調(diào)零孔NK細(xì)胞培養(yǎng)基100 μL / 孔，1孔。

圖6  MTT檢測(cè)96孔板殺傷示意圖

4.  置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時(shí)。

5.  每孔加入10 μL MTT (12 mM母液)，繼續(xù)孵育4小時(shí)。

注意：用1 mL PBS溶解5 mg MTT(組份A)配置12 mM的MTT母液。詳見說明書。

6.  3000 rpm，離心10分鐘，棄上清，每孔加DMSO 50 μL，充分混勻，10分鐘內(nèi)酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)A值。按下述公式計(jì)算殺傷率:

NK殺傷率( %)=［1－(條件OD值－效應(yīng)細(xì)胞孔OD值) / 靶細(xì)胞孔OD值］×100%

2.4 CAM標(biāo)記靶細(xì)胞檢測(cè)殺傷

2.4.1 CAM標(biāo)記靶細(xì)胞檢測(cè)殺傷原理

       Calcein-AM（CAM）是一種可以透過細(xì)胞膜的活細(xì)胞標(biāo)記染料^[10-11]。進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)酯酶會(huì)切斷乙酰羥甲基酯（AM）的酯基，產(chǎn)生無(wú)法透過細(xì)胞膜的 Calcein 熒光染料。凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜已被破壞，無(wú)法保留 Calcein。Calcein 的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為 495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 515 nm。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)步驟

圖 7 CAM標(biāo)記靶細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)流程圖

1.  殺傷檢測(cè)前一天，復(fù)蘇一支已經(jīng)凍存的NK細(xì)胞并接種于NK細(xì)胞培養(yǎng)基中（培養(yǎng)的NK細(xì)胞忽略此步驟）。

2.  對(duì)于每個(gè)細(xì)胞殺傷檢測(cè)試驗(yàn)，使用一種靶細(xì)胞系，需要6x10⁵ NK細(xì)胞和3x10⁵靶細(xì)胞。

注意：用NK細(xì)胞培養(yǎng)基將NK細(xì)胞和CAM染色的靶細(xì)胞（急性髓系白血病AML10和AML 13細(xì)胞）的密度分別調(diào)至1x106細(xì)胞/mL和1x105細(xì)胞/mL用于細(xì)胞毒性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。另外，推薦的NK細(xì)胞數(shù)是專門針對(duì)方案中顯示的E:T比例，如果使用較高的效：靶（E：T）比值相應(yīng)增加NK細(xì)胞數(shù)（例如，對(duì)于40:1 E:T比使用4x106細(xì)胞/mL）。

3.  通過用NK細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋CAM（以1 mg/mL母液儲(chǔ)存于DMSO中）制備CAM染色液。建議使用1:500，1:400，1:300， 1:200和1:100的稀釋度對(duì)CAM進(jìn)行稀釋滴定，以達(dá)到最優(yōu)濃度，使染色效果最佳。

4.  用1 mL CAM染色液重懸1 x 10⁶ 靶細(xì)胞。37℃，孵育1小時(shí)，期間時(shí)常對(duì)細(xì)胞進(jìn)行晃動(dòng)。

5.  重懸NK細(xì)胞至1x10⁶ 細(xì)胞/mL，然后在圓底96孔板前三孔（A1、B1、C1）添加200 μL NK細(xì)胞懸液。

6.  除達(dá)到最大體積的培養(yǎng)孔，在其它所有剩余的培養(yǎng)孔中添加100 μL完全培養(yǎng)基。

7.  在最大體積培養(yǎng)孔中加入100 μL 2% Triton X-100。

8.  通過每次轉(zhuǎn)移100 μL細(xì)胞，進(jìn)行NK細(xì)胞梯度稀釋，從而達(dá)到5個(gè)梯度的E: T比例。混勻。從最后一個(gè)培養(yǎng)孔中去掉100 μL（E:T為0.3125: 1）。

 圖8  CAM標(biāo)記染色靶細(xì)胞檢測(cè)殺傷96孔示意圖

9.  CAM標(biāo)記靶細(xì)胞1小時(shí)后，用NK細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，400 x g 離心5分鐘。

10.再次計(jì)數(shù)靶細(xì)胞，并重懸至1x10⁵ 細(xì)胞/mL。

11.每孔中加入100 μL（1x10⁴細(xì)胞）靶細(xì)胞。100 x g離心1分鐘以便效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞接觸。

12. 37℃，5% CO2條件下孵育4小時(shí)。

13. 用100 μL移液管輕輕混勻培養(yǎng)物，使釋放的CAM分布均勻，100 x g慢速離心培養(yǎng)板5分鐘使細(xì)胞成團(tuán)并將100 μL上清液小心轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)板，避免產(chǎn)生氣泡。如果有氣泡可以用針將氣泡刺破。

14. 采用熒光讀板器讀板（激發(fā)波485 nm，發(fā)射波530 nm）或流式進(jìn)行分析。最大體積培養(yǎng)孔中得到最大釋放量，其余培養(yǎng)孔獲得測(cè)試釋放量。

根據(jù)公式[（測(cè)試釋放量-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放量）/（最大釋放量-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放量）x 100計(jì)算裂解百分比。

2.4.3 結(jié)果分析

圖8  NK細(xì)胞對(duì)AML細(xì)胞的殺傷（用特異性裂解百分率表示NK細(xì)胞對(duì)AML的殺傷）

2.5 CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞檢測(cè)殺傷

2.5.1 CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞檢測(cè)殺傷

CFSE（5，6- carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester） 即羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂，是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有與細(xì)胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團(tuán)和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團(tuán)，這使得CFSE成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物。當(dāng)CFSE以含有兩個(gè)乙酸基團(tuán)和一個(gè)琥珀酰亞胺酯功能基團(tuán)的形式存在時(shí)，不具有熒光性質(zhì)，而具有細(xì)胞膜通透性，能夠自由進(jìn)入細(xì)胞；而當(dāng)其擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，內(nèi)源的酯酶可將其乙酸基團(tuán)水解，此種形式的CFSE分子具有很高的熒光活性，被激發(fā)能夠產(chǎn)生綠色熒光，卻不再具有膜通透性；同時(shí)，其含有的琥珀酰亞胺酯基團(tuán)能與胞內(nèi)的細(xì)胞骨架蛋白中的游離胺基反應(yīng)，最終形成具有熒光的蛋白化合物。因此，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖時(shí)，具有熒光的胞質(zhì)蛋白被平均分配到第二代細(xì)胞中，這樣與第一代細(xì)胞相比，其熒光強(qiáng)度便會(huì)減弱至一半；以此類推，分裂得到的第三代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度便會(huì)比第二代細(xì)胞再次減弱。這種現(xiàn)象可以在488nm的激發(fā)光下，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，通過檢測(cè)到細(xì)胞熒光強(qiáng)度，從而進(jìn)行細(xì)胞示蹤和細(xì)胞增殖以及細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞 (CTL) 測(cè)定研究。

2.5.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1. 用NK細(xì)胞培養(yǎng)基將預(yù)先培養(yǎng)好、生長(zhǎng)旺盛的K562細(xì)胞重懸至細(xì)胞密度為1x10⁶細(xì)胞/mL。

2. 將500 μL CFSE溶液加入到500 μL （5x10⁵細(xì)胞）K562細(xì)胞懸液當(dāng)中，上下吹打2-3次，混勻，使其終濃度達(dá)到0.5 μM。

注意：在500 μL NK細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2 μL的CFSE 母液（5 mM）。渦旋，以便旋下瓶蓋上的液體。然后將剛制備的50 μL CFSE 溶液加入950 μL NK細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行1：20稀釋，獲得1 μM 的 2倍工作液。渦旋混勻，避光保存。

3. 5% CO₂、37℃恒溫箱中避光孵育10分鐘。

4. 室溫下，用10 mL的完NK細(xì)胞培養(yǎng)基避光終止反應(yīng)10分鐘。

5. 140× g，離心標(biāo)記的K562細(xì)胞7分鐘，棄上清并用1 mL NK細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

6. 計(jì)數(shù)靶細(xì)胞并重懸使其終濃度為1x10⁵細(xì)胞/mL。

7. 使用前，細(xì)胞可在室溫下保存10分鐘或者可將其置于37℃、5%CO₂的恒溫箱中直至使用。不要冷藏。

8. 使用96孔圓底培養(yǎng)板，按下列要求接種細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞，E：T）：（1）E: T=5: 1+IL-2（陽(yáng)性對(duì)照）、（2）E: T=5: 1、（3）E:T=2.5: 1、（4）1.25: 1、（5）E:T=0.625: 1、（6）靶細(xì)胞（K562死亡陰性對(duì)照）、（7）效用細(xì)胞、（8）靶細(xì)胞+吐溫（K562細(xì)胞死亡陽(yáng)性對(duì)照）。各設(shè)三個(gè)重復(fù)。

圖9  CFSE標(biāo)記染色靶細(xì)胞檢測(cè)殺傷96孔示意圖

9. 在（3）、（4）、（5）、（6）、（7）條件孔中各加入100 μL NK細(xì)胞完全培養(yǎng)基。

10. 在（1）、（2）、（3）條件孔中加入100 μL 效應(yīng)細(xì)胞（NK細(xì)胞濃度5x105細(xì)胞/ mL）。通過依次稀釋，在（4）-（7）條件孔中加入效應(yīng)細(xì)胞。

    i. 混合條件（3）孔，然后吸取100 μL加入條件（4）孔。

   ii.  混合條件（4）孔，然后吸取100 μL加入條件（5）孔。

   iii.  混合條件（5）孔，然后吸取100 μL加入條件（7）孔。條件（6）孔不加效應(yīng)細(xì)胞。

11. 在條件（8）孔中加入100 μL制備的2倍體積0.2%吐溫液（終濃度為：0.1%-吐溫20），條件（8）孔中不加效應(yīng)細(xì)胞。

12.在條件（1）孔中加入30 μL IL-2。在加入靶細(xì)胞懸液之前，應(yīng)在效應(yīng)細(xì)胞懸液中加入IL-2(終濃度為27 IU/mL)。

13. 在條件（1），（2），（3），（4），（5），（6），（8）孔中下加入100 μL 靶細(xì)胞(標(biāo)記的靶細(xì)胞濃度為1x105細(xì)胞/mL)。

14. 混勻培養(yǎng)板，120 x g離心2分鐘，以便使效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞充分接觸。

15. 37℃，CO₂恒溫箱中孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，將培養(yǎng)板置于冰上進(jìn)行活細(xì)胞染色30分鐘。

16. 將3 μL 5 μM SYTOX? Red死細(xì)胞染色液加入到600 μLPBS中。

17. 在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入50 μL稀釋后的死細(xì)胞染色液，使終體積為250 μL，染色液終濃度為0.005 μM。

18. 進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

2.5.3  結(jié)果分析

圖20 靶細(xì)胞檢測(cè)設(shè)門

（A）最初的門設(shè)置在FITC-A/SSC-A點(diǎn)圖中，CFSE細(xì)胞群為K562細(xì)胞為（B）死亡的K562細(xì)胞（細(xì)胞染色陽(yáng)性群）在后面的APC-A/SCC-A點(diǎn)圖中設(shè)門

參考文獻(xiàn)： 

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