CRISPR/Cas9是一種極具可塑性的工具，已經(jīng)席卷了基因編輯領(lǐng)域。雖然Cas9已被廣泛用于DNA特定位點的編輯，但在構(gòu)建Cas9轉(zhuǎn)錄激活因子方面也是大有可為。這些載體允許通過將缺乏DNA切割活性的Cas9突變體融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域來上調(diào)幾乎全部基因(圖1)。
具有已知功能的基因的CRISPR激活具有用于治療的潛力，因為它可以增加某些基因座的基因表達，從而產(chǎn)生表型的變化。例如，CRISPR激活已被用于通過激活引起分化的基因誘導(dǎo)多能干細胞(Chavez et al., 2015)分化為神經(jīng)元細胞，并逆轉(zhuǎn)艾滋病毒潛伏期(Bialek et al., 2016)。此外，基于CRISPR的激活可以在環(huán)境觸發(fā)時被誘導(dǎo)。這是通過創(chuàng)造一種分裂的dCas9蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的，當(dāng)暴露于特定的紫外線波長或化學(xué)物質(zhì)時，該蛋白質(zhì)可以重新組裝(Polstein和Gersbach，2015；蔡澈等人，2015年)。這些類型的CRISPR激活也是可逆的:一旦環(huán)境觸發(fā)離開，基因表達就不再被激活。然而，有幾個因素可能會影響你的基因被上調(diào)。例如，一般來說，一個基因在自然條件下表達得越多，使用CRISPRa能實現(xiàn)的激活就越少。我們感興趣的基因可能已經(jīng)達到激活上限，而目前的Cas9系統(tǒng)無法完成上調(diào)。此外，激活實驗通常需要相當(dāng)多的調(diào)整，才能知道該系統(tǒng)是否按預(yù)期工作。最后，對于每個想要激活的基因，應(yīng)該準(zhǔn)備好測試三四個針對該基因的gRNA，因為導(dǎo)向效力可能有很大的差異。因此，當(dāng)擁有了一個想要激活的基因的情況下，我們建議使用cDNA過表達載體，而不是進行基于Cas9的激活的所需進行所有故障的排除。Cas9激活劑的最佳用途之一是用于基因篩選。例如，靶向人類基因組中每一個基因的gRNAs可以使用寡文庫合成容易且便宜地得到。在Cas9激活劑之前，類似的工具是使用其他DNA結(jié)合蛋白制成的，如鋅指(ZF)和TAL效應(yīng)器(TALE)。然而，與這些載體不同的是，Cas9允許通過簡單地提供一個新的gRNA，而不是設(shè)計一個全新的蛋白質(zhì)，來輕易改變激活物所靶向的序列。這使得使用Cas9活化劑便宜得多。這種更大規(guī)模的激活也允許做探索性研究。例如，CRISPRa可用于通過發(fā)現(xiàn)激活時導(dǎo)致癌細胞系細胞死亡的基因來尋找潛在的癌癥藥物靶點(Gilbert et al., 2014; Behan et al., 2019)。由于能夠同時靶向多個基因位點，CRISPRa還可以用于繪制分子路徑和遺傳相互作用。此外，基于CRISPR的大規(guī)模篩選可用于深入了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能(Pan et al., 2018)。由過表達來自給定細胞類型或生物體的編碼序列的質(zhì)粒組成的cDNA文庫已經(jīng)以類似于Cas9激活劑的方式在使用。然而，與gRNAs相比，它們可能難以構(gòu)建和交付使用。此外，cDNAs不能用于研究順式調(diào)控，并且也不能容易地遞送給定基因的適當(dāng)同種型，因為許多時候，特定細胞類型共有的同種型是未知的或不容易獲取的。通過從基因的天然環(huán)境中激活，Cas9激活劑有效地解決了這些問題。你可以在實驗中使用各種各樣的活化劑。我們發(fā)現(xiàn)SAM(Konermann et al., 2014)、Suntag (Tanenbaum et al., 2014, Gilber et al, 2014)和VPR (Chavez et al., 2015)是跨多種細胞系(HEK293T、MCF7、U2-OS、Hela、N2A、3T3)和生物體(Chavez et al., 2016)的較優(yōu)選擇。要了解更多關(guān)于不同類型的Cas9活化劑，請繼續(xù)關(guān)注下一篇文章。與Cas9切割不同，脫靶效應(yīng)通常不會被視為Cas9激活劑的問題?？紤]到以前的RNA-seq實驗結(jié)果(Konermann et al., 2014, Chavez et al., 2014, Chavez et al., 2016)，以及Cas9會有一個落在另一個基因啟動子上的脫靶位點，從而驅(qū)動異常轉(zhuǎn)錄的可能性非常低，即脫靶效應(yīng)不是很大的問題。也就是說，我們通常通過將基因的啟動子放入gRNA查找器(如WU-CRISPR (Wong et al., 2015)或sgRNA scorer 2.0 (Chari et al.,2015)中，并選擇最接近轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)的gRNA。我們建議將guide定位在TSS上游小于200 bp的區(qū)域，以獲得最佳效果，但大于400 bp的區(qū)域也可以獲得較好效果。Behan FM, Iorio F, Picco G, Gon?alves E, Beaver CM, Migliardi G, Santos R, Rao Y, Sassi F, Pinnelli M, Ansari R, Harper S, Jackson DA, McRae R, Pooley R, Wilkinson P, van der Meer D, Dow D, Buser-Doepner C, Bertotti A, Trusolino L, Stronach EA, Saez-Rodriguez J, Yusa K, Garnett MJ (2019) Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR–Cas9 screens. 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