如果一小組腫瘤細(xì)胞在化療中存活，即產(chǎn)生耐藥細(xì)胞（persister cells，或稱持久細(xì)胞），那么腫瘤就會(huì)復(fù)發(fā)。多數(shù)耐藥細(xì)胞在藥物作用時(shí)是不分裂（靜止）的，但其中很小的一群，能在治療時(shí)就重新進(jìn)入細(xì)胞周期，進(jìn)行增殖。已有許多研究關(guān)注這種抗治療背后的遺傳機(jī)制，但越來越多的數(shù)據(jù)顯示，非遺傳機(jī)制（比如DNA和稱為染色質(zhì)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的變化）也在耐藥細(xì)胞的發(fā)展過程中有一定作用。Oren等人[1]采用了一種名為DNA條形碼的技術(shù)，檢測了耐藥細(xì)胞的細(xì)胞譜系和基因表達(dá)譜，得以追蹤腫瘤細(xì)胞及其子代，該文章發(fā)表在《自然》上。他們的結(jié)果闡明了在多種組織的多種腫瘤中，可逆的非遺傳機(jī)制在化療耐藥性方面發(fā)揮的作用。

作者分析了體外培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞的細(xì)胞分裂過程。該細(xì)胞在編碼表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因上帶有突變。這些細(xì)胞用EGFR抑制劑奧沙替尼（osimertinib）進(jìn)行了處理。Oren等人追蹤了腫瘤細(xì)胞系的譜系結(jié)局，14天后發(fā)現(xiàn)有8%的細(xì)胞系長成了耐藥細(xì)胞，并有13%的耐藥細(xì)胞重啟了細(xì)胞周期，增殖形成細(xì)胞群。以上結(jié)果顯示，循環(huán)和非循環(huán)耐藥細(xì)胞都在治療過程早期就出現(xiàn)了，并且衍生于幾個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞系。

為闡明循環(huán)和非循環(huán)耐藥細(xì)胞相關(guān)的分子機(jī)制，作者設(shè)計(jì)出了一套他們稱為“西瓜”（Watermelon）的系統(tǒng)，這套系統(tǒng)能同時(shí)追蹤每個(gè)細(xì)胞的譜系、增殖狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)（圖1）。作者還想確定耐藥細(xì)胞的耐藥態(tài)是否產(chǎn)生于其不可逆的遺傳性質(zhì)，所以在治療暫停一段后，重新用奧沙替尼處理耐藥細(xì)胞群。他們發(fā)現(xiàn)循環(huán)和非循環(huán)耐藥細(xì)胞都重新獲得藥物敏感性，表明耐藥性背后存在著一種可逆的非遺傳機(jī)制。

圖1 | 分析腫瘤耐藥細(xì)胞的方法。Oren等人[1]展現(xiàn)了他們的“西瓜”技術(shù)，用以分析耐藥細(xì)胞——在類似奧沙替尼這類化療藥的破壞下逃逸的腫瘤細(xì)胞。作者在體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞中引入了一段設(shè)計(jì)好的DNA序列。這段序列中包含了一個(gè)特有的DNA“條形碼”，能確定該譜系下的細(xì)胞；還包含了編碼綠色熒光蛋白（mNeon）和紅色熒光蛋白（mCherry）的基因各一個(gè)，后者需要多西環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)。然后作者用奧沙替尼和多西環(huán)素處理細(xì)胞，并用單細(xì)胞技術(shù)分析活下來的耐藥細(xì)胞。非循環(huán)（不分裂）比循環(huán)（分裂）的耐藥細(xì)胞mCherry表達(dá)水平更高。耐藥細(xì)胞中含有能造成氧化損傷的活性氧（ROS）。與非循環(huán)耐藥細(xì)胞相比，循環(huán)耐藥細(xì)胞ROS水平更低，氧化脂肪酸水平更高。而且循環(huán)耐藥細(xì)胞顯示了多種抗氧化特征，其中包括表達(dá)抗氧化分子和轉(zhuǎn)錄因子NRF2。

作者之后用單細(xì)胞RNA測序方法，檢測了兩周內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)情況，并比較了循環(huán)和非循環(huán)耐藥細(xì)胞的這些特征。循環(huán)耐藥態(tài)的特點(diǎn)是上調(diào)產(chǎn)生抗氧化分子的防御程序——包括表達(dá)抗氧化分子谷胱甘肽代謝的特征，還產(chǎn)生蛋白質(zhì)NRF2，一種應(yīng)對氧化應(yīng)激時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子。不僅如此，幾種NRF2的靶點(diǎn)基因，其表達(dá)和下有大量子代耐藥細(xì)胞的譜系相關(guān)。而細(xì)胞經(jīng)基因工程去除了一個(gè)NRF2的負(fù)性調(diào)控基因后，會(huì)導(dǎo)致循環(huán)耐藥細(xì)胞比例上升。

用奧沙替尼處理細(xì)胞，會(huì)誘導(dǎo)其產(chǎn)生活性氧（ROS），從而引起氧化應(yīng)激。處理期末，循環(huán)耐藥細(xì)胞ROS水平顯著低于非循環(huán)耐藥細(xì)胞。作者加入了ROS清除分子，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平后，循環(huán)耐藥細(xì)胞比例上升。因此，以上分析表明，細(xì)胞氧化還原態(tài)在調(diào)控循環(huán)耐藥細(xì)胞中發(fā)揮作用。

認(rèn)識到氧化還原平衡跟代謝相關(guān)后，作者繪制了循環(huán)和非循環(huán)耐藥細(xì)胞的代謝產(chǎn)物譜，從而確定了在這兩種細(xì)胞中豐度不一的56種產(chǎn)物。他們發(fā)現(xiàn)，對比非循環(huán)態(tài)細(xì)胞，與肉堿（脂肪酸氧化準(zhǔn)備步驟的產(chǎn)物）相關(guān)的脂肪酸在循環(huán)態(tài)細(xì)胞更豐富。他們還注意到，奧沙替尼處理會(huì)導(dǎo)致脂肪酸氧化增加。改變脂肪酸氧化通路的結(jié)果顯示，增加或降低脂肪酸氧化會(huì)分別提高或減低循環(huán)耐藥細(xì)胞比例。這些結(jié)果支持了以下理論：改變脂肪酸氧化代謝，會(huì)影響耐藥細(xì)胞的增殖能力。

Oren等人想測驗(yàn)他們的發(fā)現(xiàn)是否能推廣到肺癌以外的模型系統(tǒng)，從而創(chuàng)造了其他人類腫瘤的“西瓜”模型，包括黑色素瘤、肺腫瘤、乳腺腫瘤、結(jié)直腸腫瘤。他們根據(jù)特定腫瘤背后的遺傳學(xué)，對應(yīng)地選用其化療方案特定的抑制劑處理細(xì)胞。大多數(shù)模型中，循環(huán)耐藥細(xì)胞相比非循環(huán)型都增強(qiáng)了脂肪酸代謝過程、抗氧化反應(yīng)和NRF2特征基因（表達(dá)），表明作者的發(fā)現(xiàn)可以推廣到肺癌以外的癌癥類型中。

這些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果在基因工程小鼠模型上也得到了驗(yàn)證。這個(gè)小鼠肺癌組織中攜帶有一可誘導(dǎo)表達(dá)的突變型EGFR。經(jīng)奧沙替尼處理后，相比沒有接受藥物處理的小鼠細(xì)胞，耐藥細(xì)胞的ROS增多，脂肪酸代謝過程的特征基因表達(dá)增強(qiáng)。對于EGFR所致肺腺癌、BRAF突變型黑色素瘤（用BRAF和MEK酶的抑制劑處理）、HER2突變型乳腺癌（用拉帕替尼處理），作者對這三類腫瘤患者的樣本細(xì)胞也做了化療前后基因表達(dá)的變化評估。在上述情況下，相比未處理的腫瘤細(xì)胞，處理過的耐藥細(xì)胞，其ROS產(chǎn)生過程和脂肪酸代謝過程的特征基因表達(dá)都增強(qiáng)了，且循環(huán)型耐藥細(xì)胞表達(dá)上述特征基因多于非循環(huán)型。

Oren等人的研究符合當(dāng)前工作重點(diǎn)的大背景，突出了非遺傳機(jī)制在耐藥細(xì)胞生存和增殖中的重要性[2-4]。研究耐藥細(xì)胞時(shí)一個(gè)主要問題，是耐藥細(xì)胞為原始的腫瘤細(xì)胞群中很小的一部分，因此難以通過群體細(xì)胞測序刻畫其特點(diǎn)。作者的“西瓜”技術(shù)，價(jià)值就在于能以單細(xì)胞分辨率得到耐藥細(xì)胞的詳細(xì)特征。未來發(fā)展方向之一可能是把類似的單細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用到其他腫瘤上，研究其耐藥性的非遺傳機(jī)制，比如胰腺癌[5]、前列腺癌[6]等，類似的研究正在這些領(lǐng)域中蓬勃發(fā)展。

理解耐藥細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程，對于發(fā)展更有效的癌癥化療方法十分重要。之前的研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中發(fā)揮作用的雌激素應(yīng)答通路[7]，以及鐵凋亡這個(gè)細(xì)胞死亡相關(guān)通路[8,9]，跟耐藥態(tài)密切相關(guān)。Oren等人發(fā)現(xiàn)，抑制這些通路雖然確實(shí)能降低耐藥細(xì)胞數(shù)，但是會(huì)增加循環(huán)型耐藥細(xì)胞比例，表明這些通路可能不是最佳的化療靶點(diǎn)。

反之，他們發(fā)現(xiàn)用乙莫克舍（etomoxir）這種抑制劑，抑制脂肪酸氧化通路，能同時(shí)減少耐藥細(xì)胞占比，并降低增殖型耐藥細(xì)胞比例。這一有前景的結(jié)果顯示，調(diào)整這一通路以及調(diào)控該通路中發(fā)揮作用的基因，或能開發(fā)新的治療手段。