目前有很多種送快遞的方法，在這里簡(jiǎn)單介紹下：

裸質(zhì)粒遞送：最常見的是直接向肌肉組織注射大量裸質(zhì)粒（快遞），期望裸質(zhì)粒被肌肉細(xì)胞（工廠）內(nèi)吞后，生產(chǎn)出所需蛋白，此種方法轉(zhuǎn)染效率低，可適用于一些僅需微量表達(dá)就能達(dá)到治療效果的疾??；

非病毒載體遞送：如高分子聚合物、陽離子脂質(zhì)體等，同樣受限于轉(zhuǎn)染效率低，使用此類方法的實(shí)驗(yàn)并不多，且有研究表明，在投遞等量DNA時(shí)，使用脂質(zhì)體比裸DNA投遞轉(zhuǎn)染效率更低。

綜合來看，由于轉(zhuǎn)染效率的顯著優(yōu)勢(shì)，病毒載體脫穎而出。但沒有一種病毒是完美的，每一種都有著明顯的優(yōu)缺點(diǎn)，所以實(shí)際的選擇過程中，需要參考更多的維度，選擇不同的載體病毒。參照文獻(xiàn)中基因療法選擇決策樹（下圖）。

AAV屬于細(xì)小病毒科、Dependoparvovirus屬，是一種無包膜病毒，包裹一條約4.7kb的單鏈DNA，因此AAV最佳裝載量為5kb以下的基因組，雖然也出現(xiàn)了使裝載量大于5kb的技術(shù)，但還處于很早期的研究。AAV擁有100余種血清型，宿主廣泛，目前學(xué)界認(rèn)為AAV不會(huì)引起任何人類疾病。

工程改造過的可攜帶外源基因序列的重組AAV（rAAV）包裝的基因組刪除了全部AAV蛋白編碼序列，添加治療性基因表達(dá)盒。rAAV在感染細(xì)胞后會(huì)形成雙鏈DNA形態(tài)，并且頭尾相連形成環(huán)狀，能長(zhǎng)期存在而不被細(xì)胞系統(tǒng)當(dāng)作外源DNA降解，因此可以在哺乳動(dòng)物器官或組織中長(zhǎng)期保留，并且只有極低的整合基因組機(jī)率。但由于rAAV具有與wtAAV相同的結(jié)構(gòu)組成和衣殼序列，因此也面臨著免疫帶來的無效壓力。

目前AAV面臨著載量小、起效慢、無有效動(dòng)物模型等挑戰(zhàn)，臨床上的核心挑戰(zhàn)還是來自于給藥的病毒滴度往往太高；而LV、RV等載體也有著相似甚至更多的挑戰(zhàn)，但所有的病毒載體都面臨著共同的大挑戰(zhàn)：（1）基因毒性；（2）生產(chǎn)成本。

前文已經(jīng)說到，細(xì)胞就是個(gè)工廠，但細(xì)胞不僅可以生產(chǎn)蛋白質(zhì)，還可以生產(chǎn)病毒。盡管大多數(shù)病毒會(huì)在感染宿主細(xì)胞后自由繁殖，但rAAV需要“幫助者”來進(jìn)行復(fù)制。

（2）生物，通過病毒感染（ HSV，桿狀病毒）；

（3）穩(wěn)定細(xì)胞系，可結(jié)合其他兩種方法的一些步驟。

讓我們?cè)僮鲆淮伪扔?，?xì)胞就是個(gè)包裝工廠，組成各種rAAV的各種元件是不同的樂高積木，我們已知的核心積木包括：（1）Rep、Cap或ITR的包裝積木——紅色積木；（2）輔助元件積木——黃色積木；（3）外源治療基因積木——藍(lán)色積木。這三種積木在rAAV的生產(chǎn)過程中是必不可少的。

穩(wěn)定細(xì)胞株結(jié)合輔助病毒（Helper virus）的方法，建立起含有rAAV的Rep/Cap基因或ITR基因組的穩(wěn)定細(xì)胞株（這工廠本來就能生產(chǎn)紅色積木），再用輔助病毒來感染生產(chǎn)出rAAV（再把黃色、藍(lán)色積木扔進(jìn)去組裝）。優(yōu)點(diǎn)是所用細(xì)胞可選能作懸浮培養(yǎng)的工業(yè)化生產(chǎn)細(xì)胞株，適合臨床規(guī)模生產(chǎn)（產(chǎn)量可以提高）。缺點(diǎn)是穩(wěn)定細(xì)胞株的建立與鑒定需要很長(zhǎng)時(shí)間（通常需要3個(gè)月甚至更長(zhǎng)）；細(xì)胞株多次傳代后的穩(wěn)定性差；后續(xù)純化過程中要注意完全失活輔助病毒。

桿狀病毒感染（Baculovirus）的方法，將攜帶各色積木的桿狀病毒去感染懸浮培養(yǎng)的SF9昆蟲細(xì)胞，也可以包裝出rAAV，原理類似于前兩種方法的結(jié)合。優(yōu)點(diǎn)是能規(guī)?；I(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)，適合臨床級(jí)別rAAV生產(chǎn)。缺點(diǎn)是桿狀病毒或SF9細(xì)胞株的建立和鑒定耗時(shí)長(zhǎng)、影響因素復(fù)雜；此外，經(jīng)此方法生產(chǎn)出來的rAAV感染能力較弱，目前還沒有找到確切的原因。

總結(jié)三種主流方法，可以發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)瓶頸在規(guī)?；a(chǎn)上，要么細(xì)胞培養(yǎng)難，要么細(xì)胞株鑒定難。這么一看好像和樂高關(guān)系不是那么密切，那么我們把目光擴(kuò)大來看。

此前的假設(shè)是針對(duì)一種疾病，而實(shí)際上gene therapy可以針對(duì)多種疾病進(jìn)行設(shè)計(jì)，每種疾病都需要不同血清型、治療基因和輔助元件。就像現(xiàn)在我們有很多種紅色、黃色和藍(lán)色的積木，我們的目標(biāo)，是根據(jù)不同的適應(yīng)癥選出三個(gè)最合適的紅黃藍(lán)積木，將其組合在一起進(jìn)行驗(yàn)證，再迅速搭建三個(gè)積木的生產(chǎn)、組裝、鑒定流水線，這種模塊化、規(guī)?；纳a(chǎn)，是工業(yè)界所追求的。

每次一提及AAV，就不知道從何說起，說了一大堆后還是覺得沒說完。這就是AAV的現(xiàn)狀，也是LV、RV的現(xiàn)狀，它們不完美，有著諸多讓人心動(dòng)的優(yōu)點(diǎn)，也有著讓人咬牙的缺點(diǎn)，甚至需要付出生命的代價(jià)去發(fā)現(xiàn)，但它們已經(jīng)是當(dāng)下最好的解決方案了。

關(guān)于病毒載體，其實(shí)還可以多做幾篇，本文也僅是從大的方面做了闡述，如覺得本文有不妥之處，還請(qǐng)批評(píng)指正。還有很多細(xì)節(jié)和步驟都值得詳細(xì)說一說，比如快遞又是怎么制造的？汽車的改進(jìn)方法是什么？下游工藝難題究竟在哪？未來的商業(yè)化之路怎么走？在下一篇章里，我們將對(duì)快遞去做更多地了解，順道也會(huì)說到基因編輯，下期見。

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