工欲善其事必先利其器，想用好共聚焦顯微鏡光會用操作可不行，那永遠不可能成為“共聚焦達人”，要想成為“達人“必先懂得原理，好吧，開始啦。

什么是熒光？

熒光：

熒光現(xiàn)象是物質(zhì)在光的照射下所產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象。

首先熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，熒光物質(zhì)必須是在光的照射下才能發(fā)光。否則就是其他的發(fā)光現(xiàn)象而不是熒光。例如夜光物質(zhì)，夜光表，雖然也需要先用光照射，但離開光照射后它還能繼續(xù)發(fā)光，就不是熒光。這叫磷光。另外一個例子是作western blot時用化學發(fā)光，也是發(fā)光，但不是熒光。

其次，熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光與照射光的色彩不同。準確地說，是熒光物質(zhì)發(fā)光的波長與照射光的波長是不同的。典型的熒光物質(zhì)是在紫外線照射下能發(fā)出黃綠色的熒光。例如錢上的的熒光防偽標記，用紫外線照射后能發(fā)黃綠色的光。

所以在使用熒光顯微鏡的照片，觀察綠色熒光樣品時，你會看到物鏡下照射到樣品的光是藍色的光。觀察紅色熒光樣品時，照射樣品的卻是綠色的光。但在目鏡里卻能分別看到綠色與紅色的熒光圖像。

在熒光顯微鏡里，使用藍色光照射樣品后，樣品發(fā)出的綠色熒光與照射樣品的藍色光混在一起，經(jīng)過一個濾光片，把藍色的照射光過濾掉，這樣在目鏡上就只看到綠色的熒光了。

樣品發(fā)出的熒光，雖然有一種顏色，但它并不是單色光，而是有一定波長分布范圍的混合光。具體測量出每個波長下的相對光強，作一條光強-波長的關系曲線，這就是熒光光譜了?；蛘叻Q之為發(fā)射光譜。它反映了這個物質(zhì)發(fā)射的熒光的色彩成分。一般情況下，熒光物質(zhì)的熒光光譜的波長范圍并不會太大，所以它會形成某種明顯的顏色。例如綠色或紅色或黃綠色。通常這個波長范圍是幾十個納米。

在熒光的光譜分布中，當然會有一個波長對應著最強的熒光強度，這個波長就是我們平時所說的熒光的波長，又叫最大發(fā)射光波長，通常熒光染料的參數(shù)中的熒光波長就是這個波長。熒光物質(zhì)所發(fā)出的光實際上是這個波長上下幾十納米范圍之內(nèi)的。

照射樣品的光叫激發(fā)光。激發(fā)光的波長必須比熒光波長短。這是能量守恒的因素。短波長的光能量高，它只能激發(fā)出能量低一點的光。所以理論上只要比熒光波長更短的光就能激發(fā)出熒光。發(fā)紅色熒光的物質(zhì)，可以用紫外光，藍光，綠光來激發(fā)它發(fā)出紅色熒光。不過，這其中也是有某個波長的光是效率最高的。能激發(fā)出最強的熒光。這個就是最大激發(fā)光波長。這也是熒光染料參數(shù)中的激發(fā)光波長。

熒光染料發(fā)出熒光，其色彩與激發(fā)光基本上無關。就是說，如果染料是發(fā)紅色熒光的，你用藍色光，紫外光，綠色光都能激發(fā)出紅色熒光，也只能激發(fā)出紅色熒光。專業(yè)點的說法，就是熒光的光譜與激發(fā)光無關。熒光光譜是樣品發(fā)出的熒光在各個波長下的強度分布。其峰值就是最大發(fā)射光波長，或者叫最大熒光波長。 各種染料的熒光光譜基本上都是這個形狀，一個簡單的峰，有個最大波長，寬度大致在幾十個納米。所以熒光雖然不是純的單色光，但也基本上是一種顏色。

相比熒光光譜，激發(fā)光譜就稍微復雜點，一般不會是一個簡單的峰，有時候會有幾個峰，寬度通常能從紫外到熒光的波長。這個意義就是通常情況下，用什么光來激發(fā)是有很大寬容度的。只要波長比熒光波長短，就能激發(fā)出熒光來。這就是現(xiàn)在的顯微鏡，其濾光片系統(tǒng)與以前不同了，以前是激發(fā)濾光片與發(fā)射濾光片可以分別選擇，可以用藍光激發(fā)紅光，但現(xiàn)在使用濾光片組，通用的是綠光激發(fā)紅光，雖然能適應大多數(shù)染料，但偶爾遇到一個需要藍光激發(fā)紅光的，就沒招了。除非另花幾千塊買個專用濾塊。

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜基本上是分開不重迭的，所以通常會把兩個光譜畫在一個圖片上，就成了這個樣子的。兩條曲線分別對應著激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。

當使用兩種染料時，一般是分別拍攝紅色與綠色熒光。先使用紅色濾塊拍攝紅色熒光，此時，實際上綠色熒光也會有一點的，濾光片不可能把綠色熒光完全濾掉。拍攝綠色熒光時也一樣會有一點紅色熒光。 當兩個染料的熒光強度差不多的時候，漏過來的一點點其他熒光對圖像沒啥影響。但是，如果兩種染料的熒光強度相差太大時，就有問題了。例如紅色熒光強度為1000，綠色熒光強度為1，濾光片過濾效率為1%。當使用綠色濾光片觀察時，綠色熒光強度為1，紅色的強度為1000X1%=10，漏過來的紅光比綠光還要強，這時候，鏡下就能看到紅色的熒光，這就是串色現(xiàn)象。由此可見，解決串色的辦法，就是在制樣時把強熒光的染料濃度降一點，讓兩種色彩亮度平衡。

當兩種染料熒光色彩很接近的時候，例如都是綠色熒光，但波長稍有重迭而不是完全重迭，理論上是可以通過拍攝兩個波長下的熒光，然后通過計算把兩種熒光給分開?，F(xiàn)在的光譜型共聚焦顯微鏡有這個能力。要分別先作兩個單染色的樣品，分別掃描其光譜，計算出其校正的系數(shù)，然后對雙染色的樣品掃描兩個波長下的圖片，最后根據(jù)系數(shù)來對圖片進行一些計算，分別得到兩個分開的圖片。這個功能在實際應用中未必有效，一般來說，兩個樣的熒光要足夠強而且強度要平衡，才能作出有效的計算。如果熒光弱，計算誤差會相當大，就得不到好的效果了。

今天了解完原理，下一期，我們將會帶大家了解怎么去安裝使用共聚交顯微鏡，敬請關注”共聚焦顯微鏡使用技巧與心得“