為了分離治療性TCR，必須首先從患者或健康獻血者的血液中分離抗原特異性T細胞，并在體外用特異性肽抗原以及細胞因子（如IL-2和IL-15）進行擴增。這一過程需要事先確定可安全靶向于患者的特定腫瘤相關(guān)肽靶點。在選擇了靶抗原后，可以使用不同的方法來篩選具有所需的高親和力和腫瘤特異性的TCR。臨床前安全性測試對于確保分離的高親和力TCR的最小靶外效應(yīng)和交叉反應(yīng)性也是必要的。病毒載體通常用于對自體患者T細胞進行基因修飾，以表達經(jīng)驗證的治療性TCR，然后再輸回患者體內(nèi)。

T細胞識別的黑色素瘤抗原1（MART-1）是TCR-T臨床試驗中第一個靶向的腫瘤相關(guān)抗原。在15名患者中過繼轉(zhuǎn)移MART-1特異性TCR-T細胞，在輸注后至少2個月內(nèi)，在超過10%的外周血淋巴細胞水平上實現(xiàn)持久存在，并顯示出有益的效果，包括腫瘤消退。除了抗腫瘤作用外，一些患者還表現(xiàn)出對正常黑色素細胞的靶向毒性，導(dǎo)致視力或聽力問題，但這些問題在很大程度上通過類固醇治療得以解決。

在這一突破之后，針對多種腫瘤抗原的TCR-T療法已經(jīng)開發(fā)出來，包括針對MAGE-A3、MAGE-A4、GD2、間皮素、gp100、MART1、AFP、CEA、NY-ESO-1以及源自HPV和EBV的病毒肽的TCR-T療法。其中，NY-ESO-1已被證明是TCR-T細胞最有希望的靶點之一，在治療滑膜肉瘤方面取得了成功，客觀有效率為67%。

理想的TCR-T靶抗原顯示以下特征：（1）誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力；（2）與驅(qū)動腫瘤表型（如癌基因）相關(guān)，以降低抗原丟失和腫瘤免疫逃避的風(fēng)險；以及（3）在腫瘤干細胞上的表達以促進永久性腫瘤根除。

高分辨率質(zhì)譜（MS）已被證明是促進從腫瘤細胞直接識別HLA-I結(jié)合肽的最強大的高通量方法。在這種方法中，通過免疫沉淀（IP）從腫瘤組織或細胞系中分離HLA-I/肽復(fù)合物，然后充分洗滌并應(yīng)用酸性洗脫緩沖液，從HLA-I分子和用于IP的抗體中分離結(jié)合肽抗原。該策略允許每個腫瘤樣本識別數(shù)千個經(jīng)驗證的肽靶點，并已用于識別膠質(zhì)母細胞瘤（GB）、黑色素瘤、腎細胞癌（RCC）和結(jié)直腸癌（CRC）等的HLA-I配體。

盡管基于MS的技術(shù)可用于識別新抗原，但由于其相對較低的豐度以及MS的有限靈敏度，尤其是對于大小有限的腫瘤樣本，它們更難識別。然而，新一代測序技術(shù)的發(fā)展有助于識別和定位這類腫瘤靶點。全外顯子組DNA測序，結(jié)合計算預(yù)測算法，允許識別癌細胞中的特定遺傳改變，這些改變可以產(chǎn)生突變肽，并能夠呈現(xiàn)在腫瘤HLA-I分子上。

所有體細胞突變基因都可以進行電腦分析，以預(yù)測可能與患者個體HLA-I分子結(jié)合的潛在高親和力表位，從而被T細胞識別。隨著大型MS洗脫肽數(shù)據(jù)庫的使用，HLA-I肽結(jié)合預(yù)測算法不斷更新和改進，其他預(yù)測算法試圖考慮與細胞內(nèi)過程復(fù)雜性相關(guān)的生物變量。

另一個經(jīng)常使用的方法是腫瘤RNA測序，它允許選擇具有最高轉(zhuǎn)錄表達的新抗原。值得注意的是，盡管這些預(yù)測方法在識別呈遞的和高免疫原性新抗原時通常表現(xiàn)出非常好的準(zhǔn)確性，但它們通常預(yù)測的新抗原靶點的數(shù)量比真實靶點的實際數(shù)量高1到2個數(shù)量級。

通過trogocytosis發(fā)現(xiàn)新抗原是近年來出現(xiàn)的一種新方法。Trogocytosis是細胞結(jié)合過程中發(fā)生的一種生物學(xué)現(xiàn)象，在此過程中，細胞共享并轉(zhuǎn)移膜和膜相關(guān)蛋白。Li等人發(fā)現(xiàn)T細胞膜蛋白特異性轉(zhuǎn)移到腫瘤靶細胞，這些靶細胞呈遞同源HLA-I/肽復(fù)合物。利用這些T細胞-靶細胞相互作用，他們通過將表達標(biāo)記孤兒TCR的T細胞與同源靶細胞共同孵育，創(chuàng)建了新抗原發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)。通過將熒光標(biāo)記從T細胞轉(zhuǎn)移到靶細胞，該方法能夠分離這些靶細胞并對同源TCR配體進行測序，從而建立新抗原文庫。

使用HLA-I多聚體、單細胞TCR測序或抗原陰性的人源化小鼠，腫瘤反應(yīng)性T細胞和TCR可從自體、異體或異種細胞庫中識別鑒定。

利用HLA-I多聚體法，可通過多聚體染色和流式細胞術(shù)分選直接分離抗原特異性CD8+T細胞。在分離成對的全長TCR序列之前，對這些多克隆T細胞進行同源肽識別和抗腫瘤功能測試。采用高靈敏度的基于PCR的單細胞TCR分析方法（TCR-SCAN），可以得到具有高親和力和特異性的TCR。

另外一種方法利用了人源化小鼠TCR基因庫，該基因庫不會發(fā)生在人類中產(chǎn)生的T細胞克隆缺失或耐受。為此，Li等人利用整個人類TCRα/β基因位點和嵌合HLA-A2轉(zhuǎn)基因構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因小鼠，以實現(xiàn)針對人類TAA的人類TCR的分離。

單細胞測序方法代表了高通量分離腫瘤特異性TCR編碼基因的更有前景的方法。使用靶向TCRα和TCRβ基因座內(nèi)每個單獨V和J元件的RNA誘餌文庫，可以從剪切的基因組DNA（gDNA）片段中選擇性分離TCR編碼基因組元件，用于隨后的配對末端深度測序。這使得從人類材料或TCR人源化小鼠的寡克隆T細胞群中鑒定抗原特異性TCR成為可能。

幼稚T細胞也可以作為TCR-T治療的TCR來源。TAA和新抗原特異性T細胞可從癌癥患者外周血中的低頻前體中衍生和擴增，并可重新輸注或用作抗原特異性TCR的來源。由于癌癥患者通常表現(xiàn)出免疫抑制或顯性T細胞耐受，HLA-I匹配的健康供體的原始序列也代表了一個可靠的來源，因為它具有巨大的多樣性TCR序列，理論上T細胞具有任何抗原特異性，包括腫瘤新抗原。已經(jīng)開發(fā)了高通量技術(shù)平臺，用于尋找原始的序列，以便快速有效地識別用于個性化過繼性T細胞治療的罕見但有治療價值的TCR。

大多數(shù)基于TCR的基因治療方法依賴于用病毒載體對T細胞進行體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，最早用于基因治療的載體是腺病毒。然而，由于它們不能將轉(zhuǎn)基因整合到宿主基因組中，TCR表達在T細胞增殖過程中會丟失。此外，腺病毒的免疫遺傳特性也限制了其作為基因治療載體的應(yīng)用。相比之下，逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體表現(xiàn)出更大的前景，因為它們可以感染多種細胞，并有能力將轉(zhuǎn)基因插入宿主基因組，從而使異位TCRα/β鏈穩(wěn)定表達。

由γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒如小鼠白血病病毒（MLV）衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被廣泛用于基因轉(zhuǎn)移到人類T細胞中。這種方法已被用于傳遞各種基因，包括自殺基因、TCR和CARs。主要缺點是它們不能轉(zhuǎn)導(dǎo)非增殖性靶細胞，這就排除了靜止的T細胞在TCR-T治療中的應(yīng)用。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒插入突變可能引起潛在的副作用。

最近，慢病毒載體（LV）作為基因轉(zhuǎn)移載體獲得了更多的關(guān)注，因為它們可以將基因傳遞到分裂和非分裂細胞中。各種技術(shù)，如Golden Gate克隆和LR克隆，通常用于構(gòu)建插入TCRα/β基因的載體。

腺相關(guān)病毒（AAV）是另一種廣泛使用的病毒載體。與腺病毒載體相比，AAV具有較低的免疫原性和更廣泛的細胞向性，因此在腫瘤基因治療中得到了廣泛的應(yīng)用。為了促進轉(zhuǎn)基因整合，人們開發(fā)了自互補AAV載體（scAAV），使AAV獨立于宿主細胞的互補鏈合成，scAAV在臨床前模型中的療效優(yōu)于傳統(tǒng)AAV。

同時，一些非病毒基因編輯方法也被開發(fā)出來。mRNA電穿孔已被證明可實現(xiàn)短暫的TCR和CAR表達，從而將病毒成分持續(xù)存在的風(fēng)險降至最低。臨床數(shù)據(jù)表明，mRNA修飾的TCR-T和CAR T細胞都是可行和安全的，沒有明顯的證據(jù)表明對正常組織有非靶向毒性。然而，缺乏持續(xù)的TCR表達可能會限制療效，需要反復(fù)輸注。此外，非病毒性睡美人反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)也被用于TCR和CARs的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

基因編輯通過同源定向修復(fù)（HDR）可以將大基因片段特異、高效地插入靶細胞。使用CRISPR/CAS9開發(fā)的TCR-T細胞已被證明在體外特異性識別腫瘤抗原，并在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生性抗腫瘤反應(yīng)。

在TCR克隆后，需要進行廣泛的臨床前驗證，以證明工程化TCR-T細胞的特異性和安全性。驗證包括通過滴定同源肽抗原來評估TCR的親和力，以及測量一組對HLA-I匹配的腫瘤細胞系的殺傷作用。如果沒有這樣的腫瘤細胞系存在，靶細胞可以轉(zhuǎn)導(dǎo)表達相關(guān)抗原和相關(guān)的HLA-I分子。新抗原也可以在自體抗原呈遞細胞中表達，以評估TCR的抗原反應(yīng)性。

安全性測試包括測試候選TCR-T對HLA-I匹配原發(fā)組織的識別能力，以確保沒有正常組織作為靶點，產(chǎn)生可能導(dǎo)致的非靶向毒性。在至少兩次TCR-T細胞治療臨床試驗中，發(fā)生過對正常腦細胞和心臟細胞的交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致患者死亡。這些試驗結(jié)果強調(diào)了TCR進入臨床試驗前進行廣泛安全性試驗的重要性。

參考文獻：

1.Evolution of CD8+ T Cell Receptor(TCR) Engineered Therapies for the Treatment of Cancer. Cells. 2021 Sep;10(9): 2379.

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