假單胞菌是普遍存在于土壤、水、動物和植物根際的革蘭氏陰性菌，其具有生長速度快并在植物根際持續(xù)存在的能力，能夠產(chǎn)生廣泛的次生代謝產(chǎn)物(如抗生素、鐵載體、揮發(fā)物和促生長物質)從而適應環(huán)境脅迫，適合作為植物病原生物防治劑。假單胞菌屬的某些種已被證明是有效的生物防治或生長促進劑，人們對該菌在商業(yè)和生物技術上的應用越來越感興趣。

水稻黃單胞菌(Xoc)可通過侵染寄主水稻引起細菌性葉斑病(BLS)，該病已逐漸成為我國南方部分水稻產(chǎn)區(qū)第四大病害，嚴重時可導致減產(chǎn)10-30%。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)對Xoc完全免疫的水稻品種。目前，我國普遍種植的水稻品種均對弓形蟲敏感，甚至一些雜交水稻品種也是高度敏感的，目前我國常用殺菌劑如雙美噻唑的使用，導致Xoc產(chǎn)生耐藥性，因此，急需一種有效的、環(huán)境友好的生物防治方法。

本研究從223株候選菌株中鑒定了一株假單胞菌1257菌株，系統(tǒng)發(fā)育、基因組學和生理生化特征表明1257菌株是一種具有代表性的新型假單胞菌。此菌是首次報道的一種新型假單胞菌可能對BLS生物防治具有較大作用。

1、實驗材料：上海市奉賢區(qū)莊航村古村采集的卷心菜根際土壤中分離得到的菌株1257；

2、測序平臺：Illumina Miseq 、Pacbio

3、分析內容：細菌完成圖測序、系統(tǒng)發(fā)育樹構建、ANI分析、基因家族分析、共線性分析、次級代謝產(chǎn)物基因簇預測分析等。

在233株分離菌株中，發(fā)現(xiàn)其中一株1257菌株對Xoc RS105具有較強的抑制作用(抑制帶> 40 mm)，另外8株Xoc分離自中國主要水稻產(chǎn)區(qū)(圖1A)。擴增1257菌株的16S rRNA基因，將其與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對發(fā)現(xiàn)1257菌株屬于假單胞菌屬，1257菌株的16S rRNA基因序列與P. entomophila L48(99.54%)和P. mosselii CFMT90-83(99.48%)的序列相似度均超過99%。為了確定1257菌株的系統(tǒng)發(fā)育情況，對該菌株的全基因組進行了測序(圖1B)。根據(jù)MLSA（MLSA分析使用的基因為10個管家基因，分別為16Sr RNA、aroE、dnaA、guaA、gyrB、mutL、ppsA、pyrC、recA和rpoB）分析結果顯示，1257菌株位于一個單獨的分支，其最接近的是P. entomophila L48和P. mosselii型株CFMT90-83(圖1C)。ANI分析發(fā)現(xiàn)，該菌株與已知菌種見的ANI值在73.77~89.13%之間，表明該菌株是一個新種。

圖 1 |菌株 1257 的分離、鑒定和抗菌活性測定；（A）菌株 1257 的菌落形態(tài)和拮抗活性；(B) 菌株 1257完成圖；(C) 菌株 1257 的基于 MLSA 的系統(tǒng)發(fā)育樹。

對菌株1257進行高通量測序，得到一條6,049,604bp的染色體，GC含量為63.76%，預測得到5,411個編碼基因、22個rRNA、76個tRNA和73個其他ncRNA，該菌株的基因組和P. entomophila L48的親緣關系最近。從基因組大小上來看，菌株1257的基因組比P. entomophila L48大，比P. mosselii CFML90-83小。對這三個基因組進行共線性分析和基因家族分析：1.共線性分析發(fā)現(xiàn)菌株1257與P. entomophila L48的親緣關系最近；2.基因家族分析發(fā)現(xiàn)這三個菌株的核心基因組由11791個基因組成，占每個基因組的83.6 ~ 87.1%(圖2C)，根據(jù)此分析發(fā)現(xiàn)菌株1257有957個基因家族是其特有的。

圖2  P. oryziphila 1257 與其密切相關的兩個假單胞菌物種的比較基因組學分析和抗菌表型。(A)拮抗實驗； (B)共線性分析；(C)基因家族分析。

antiSMASH分析顯示P. oryziphila 1257的基因組包含8個編碼二肽Nacetylglutaminylglutamine amidc (NAGGN)的候選基因簇、4個非核糖體肽合成酶(NRPS)和2個核糖體合成的抗微生物肽，芳基多烯(APE)型色素。Blast比對結果表明，在P. oryziphila、P. entomophila和P. mosselii基因組中，NAGGN、NRPS 3、APE和NRPS 4基因簇是保守的，而P. entomophila的次生代謝產(chǎn)物生物合成候選基因簇比P. oryziphila和P. mosselii多。

圖3 次生代謝物生物合成基因簇比較。

Southern blot分析表明，所有突變體只攜帶一個轉座子副本。將Tn5轉座子插入到1257基因組13個不同區(qū)域的19個基因中，包括carAB、purMF、purCLDK、gntR-lgrD、sdhA、dsbB1、tuf1、serC、gph、dnaK、argG、sohB和rna2(圖4A)。作者構建了carA、carB、purF和serC基因的完整功能片段，并將相關質粒導入相應的插入突變體中。結果發(fā)現(xiàn)，互補菌株對Xoc RS105的拮抗活性恢復到野生型水平(圖4B)，表明這些基因在生物合成抗Xoc RS105活性化合物中起著關鍵作用。

圖4 |全基因組鑒定P.oryziphila 1257對Xoc RS105的抗菌功能基因。(A) P. oryziphila 1257的Tn5插入突變體特征。(B)野生型P. oryziphila 1257、carA、carB、purF、serC和lgrD突變體及其互補菌株的抑菌活性測定。

為了明確上述功能基因所涉及的代謝過程，對其進行了KEGG注釋分析。carA和carB基因編碼氨基甲?；姿狨ズ铣擅福撁复呋被柞；姿狨?CP)的合成，是精氨酸和嘧啶代謝的前體。ArgG基因編碼的ArgG是一種精氨酸琥珀酸合成酶，負責從天冬氨酸中產(chǎn)生精氨酸琥珀酸。sdhA基因編碼琥珀酸脫氫酶a亞基，是三羧酸循環(huán)中的關鍵酶。這六個pur基因編碼（PurF、PurD、PurL、PurM、PurC和PurK）是PPP中的代謝酶，將糖酵解途徑(PP)中的核糖- 5p轉化為5-羧基氨基-1-(5-磷酸- dribosyl)咪唑(CPR)。這些分析表明，CP和CPR可能是合成活性化合物的重要前體，也為進一步鑒定目標化合物提供了重要的依據(jù)。

圖 5  P. oryziphila 1257抗菌活性相關基因的KEGG分析示意圖。

為研究水稻1257對Xoc RS105引起的BLS的生防效果，采用高感品種元豐早進行了田間試驗:僅Xoc RS105(對照)，1257在Xoc RS105懸浮液(1257- tre)接種后12 h噴施，1257在Xoc RS105懸浮液(1257- pre)接種前12 h噴施。15天后調查BLS疾病嚴重程度：與對照處理相比，1257- tre和1257- pre預處理顯著降低了稻田BLS的嚴重程度，相對防治效率分別為53.9%和39.7%。結果表明，1257-Tre處理具有較好的田間生物防治效果。

圖6 P. oryziphila 1257對水稻BLS的生防效果。（A)P. oryziphila 1257和Xoc RS105菌在15天田間試驗中對水稻易感品種元豐早的病斑長度。(B)P. oryziphila 1257和Xoc RS105接種元豐早在溫室1、3、5和7天的病斑長度。(C)接種后1、3、5和7天，通過GUS定量檢測和組織化學染色監(jiān)測Xoc RS105-Gus在水稻葉片中的動態(tài)種群數(shù)量。

1、鑒定了一種新的假單胞菌(P. oryziphila)1257菌株，它具有抑制Xoo和Xoc的能力，特別是抑制Xoc在水稻組織中的生長和遷移，從而預防BLS??；

2、基因組信息顯示，該菌可能具有殺死昆蟲、溶解磷酸鹽、依賴T4P系統(tǒng)移動、降解IAA和PAA等功能基因，是一種萬能菌；

3.在假單胞菌(P. oryziphila)1257菌株中發(fā)現(xiàn)一種非核糖體肽，該非核糖體肽可能是參與BLS生物防治的主要活性化合物；

綜上所述，假單胞菌(P. oryziphila)1257菌株的發(fā)現(xiàn)為水稻細菌性病害的生物防治提供了新的微生物資源。