|
1. 基礎(chǔ)知識(shí)儲(chǔ)備 任何一個(gè)新的研究方向都離不開理論依據(jù)，查閱參考文獻(xiàn)資料并總結(jié)是一個(gè)科研人的必備技能。啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)的第一步當(dāng)然就是實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅰ?/span> 關(guān)于動(dòng)物模型制作：在開始制作活體動(dòng)物模型之前，查閱文獻(xiàn)，確定制作方法，包括但不限于確定實(shí)驗(yàn)鼠類型、月齡、性別、給藥劑量、給藥方式、一次或多次給藥時(shí)間、動(dòng)物生存活動(dòng)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)鼠是否需要分籠單只飼養(yǎng)、給藥前是否需禁水和（或）禁食等等，如果模型制作失敗，請(qǐng)檢查制作模型的過程中的每一個(gè)步驟，必要時(shí)再次查閱相關(guān)資料適當(dāng)調(diào)整。 以小鼠灌胃給藥為例，選用合適型號(hào)的灌胃針，抓取小鼠使其頭頸部成一條直線，方便灌胃針從口角進(jìn)入。針頭進(jìn)入小鼠的食管即可，不可過深，手法要輕柔，否則會(huì)戳傷小鼠食道或胃壁，灌胃容積一般不超過0.8毫升，最多不可超過1毫升。 
2. 手術(shù)操作或取材 這一部分沒什么需要特別注意的，記住兩點(diǎn)：準(zhǔn)備好取材所需器材，例如手術(shù)刀、組織剪、眼科剪、鑷子、EP管、培養(yǎng)皿、75%酒精、麻醉劑和必備液體（例如4%PFA固定液）等；提前了解目標(biāo)取材位置，要盡量快速地做固定、冷凍、離體孵育或其他處理，保證實(shí)驗(yàn)樣本保存完好。 3. 明確實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)的特征或特性 根據(jù)研究目標(biāo)的不同水平選擇實(shí)驗(yàn)類型，例如，在蛋白水平，一般選用特定染色方法顯示形態(tài)或共存情況，選用Western Blot統(tǒng)計(jì)蛋白量表達(dá)的升高或降低；在RNA水平，一般選用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）體現(xiàn)基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)等；在離體狀態(tài)，可選用模擬體液環(huán)境的孵育實(shí)驗(yàn)對(duì)離子通道進(jìn)行干預(yù)或不做干預(yù)，探討研究目標(biāo)的產(chǎn)生、分泌、消耗等；利用在體實(shí)驗(yàn)探討生理或病理（口服給藥，腹腔注射，靜脈注射，基因敲除等）情況下研究目標(biāo)的變化或調(diào)控等。如果不清楚如何選擇實(shí)驗(yàn)方法，查閱文獻(xiàn)資料或者問前輩。 以染色為例：選擇典型的染色方法很重要。明場(chǎng)染色相較于免疫熒光染色保存時(shí)間較長(zhǎng)。例如HE染色（觀察組織形態(tài)等），PAS染色（糖原染色，一般用來顯示糖元和其它多糖物質(zhì)），DAB染色（免疫組化染色，需注意顯色時(shí)間），Masson染色（膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色。用來顯示組織中纖維以及炎性因子的染色方法之一）等，一定要根據(jù)目標(biāo)特性選擇不同染色方法。 4. 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料千萬不要小看實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備，在選定實(shí)驗(yàn)方法之后，檢查實(shí)驗(yàn)所用到的器械和材料等是否準(zhǔn)備完畢，確保實(shí)驗(yàn)材料的齊全是保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的第一步，畢竟在某些爭(zhēng)分奪秒的時(shí)間里現(xiàn)場(chǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料是來不及的，而且會(huì)大大影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。注意一些實(shí)驗(yàn)常用液體（例如PBS，PBST，TBS，TBST，梯度酒精，Kerb’s液等），記得檢查配液時(shí)間和可回收利用液體的使用次數(shù)等，如果發(fā)現(xiàn)肉眼可見的性狀改變，如出現(xiàn)沉淀、絮狀物，顏色改變等，請(qǐng)重新配液。以Western Blot蛋白提取為例，樣本類型不同（組織樣本、貼壁細(xì)胞樣本、懸浮細(xì)胞樣本等）選擇的裂解液也不同，要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的裂解液。一般使用RIPA裂解液（主要從動(dòng)物組織和動(dòng)物細(xì)胞中抽取可溶性蛋白）。RIPA裂解液的配方有很多種，根據(jù)其裂解液的強(qiáng)度大致可以分為強(qiáng)、中、弱三類。關(guān)于不同的RIPA裂解液以及其它裂解液的主要特點(diǎn)和差異，以及如何選擇裂解液，參考如下：
另外，Western Blot蛋白轉(zhuǎn)移膜也可根據(jù)實(shí)際情況選擇。一般分為三種材質(zhì)：NC膜，PDVF膜和尼龍膜，區(qū)別如下：
對(duì)于一些復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)一定要根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟里規(guī)定的時(shí)間進(jìn)行操作，不得提前或拖延。例如，染色過程中染色或脫色時(shí)間不準(zhǔn)確，就會(huì)導(dǎo)致顯色過深、過淺、深淺不一甚至不顯色。再者，Western Blot電泳（俗稱跑膠）時(shí)間一定不能提前結(jié)束或延遲結(jié)束，讓蛋白跑得太久，指定離家出走，跑的時(shí)間太短又達(dá)不到分離蛋白的目的（可以根據(jù)溴酚藍(lán)的位置判斷跑膠時(shí)間是否合適，其實(shí)跑膠時(shí)間也不是特別固定的一個(gè)數(shù)字，而是一個(gè)區(qū)間，具體與蛋白樣品、儀器電壓、或凝膠的質(zhì)量有關(guān)哦~ 當(dāng)然，如果配膠過程出現(xiàn)問題，就可能導(dǎo)致膠體本身不凝，或漏液后凝膠量不夠，導(dǎo)致配膠失敗，這個(gè)在下一部分講）；還有轉(zhuǎn)膜過程，時(shí)間不合適的話，目標(biāo)蛋白就跟你的NC膜或PVDF膜無緣啦！另外，注意合理安排自己實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，注意一些總時(shí)長(zhǎng)較久的實(shí)驗(yàn)，盡量早點(diǎn)開始做，否則要么餓肚子要么熬大夜，實(shí)驗(yàn)也不一定能做好，實(shí)慘。6. 注意實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)以Western Blot膠體的配制為例，目前一般使用SDS-PAGE膠作為Western Blot的基礎(chǔ),按照說明書配液即可。在配制前的準(zhǔn)本工作中，需注意仔細(xì)檢查制膠器和玻璃板（包括長(zhǎng)板和短板）是否完好，盡量避免玻璃板體存在較大的劃痕或有角破損，充分洗凈制膠器和玻璃板并晾干（可以噴灑無水乙醇加快水分蒸發(fā)），后進(jìn)行膠體配制。這里分享一個(gè)配膠前的小技巧：組裝好制膠器后，可以在玻璃板間隙加入一些無水乙醇，記住液面位置，計(jì)時(shí)3-5分鐘，觀察液面位置是否下移，判斷該制膠器是否有漏液情況，否則在配膠過程中出現(xiàn)漏液情況是比較麻煩的，要拆了重洗哦~膠體分為分離膠和濃縮膠（也就是通常說的下層膠和上層膠），膠體凝固的標(biāo)志如下：注意：此處分離膠上的酒精或DDW（deuteriumdepleted water）為隔絕氧氣的作用（也有一部分壓膠作用），必須要加，倒出后可倒置制膠器晾干或用濾紙從玻璃板間隙的一角吸干，要保證濾紙干凈無雜質(zhì)。圖中將濾紙插入玻璃板間隙的做法個(gè)人不推薦，雖然不排除某些蛋白不受影響，但為了確保實(shí)驗(yàn)順利，還是注意一些為宜。
分離膠凝固后加入濃縮膠，并立即插入梳子（對(duì)，它就叫梳子），插入梳子的過程中可以左右小幅度擺動(dòng)梳子，避免濃縮膠中留有氣泡。濃縮膠凝固時(shí)間大約在40-60分鐘，可觀察到膠體與梳子分離，拔出梳子（或觀察不到，但只要時(shí)間大概夠了也可以拔出），注意要豎直向上拔出，避免左右擺動(dòng)破壞凝膠，導(dǎo)致前功盡棄。另外，如果Western Blot電泳時(shí)蛋白出現(xiàn)跑歪或條帶相連的情況，可能的原因包括：（1）膠體均一度不好（一般是因?yàn)榧尤氲讲ＡО逯皼]有充分搖勻）；（2）膠體有氣泡；（3）下層膠和上層膠的界面不平；（4）儀器的問題等。下圖為蛋白正常的樣例，每一孔的蛋白各自待在自己的“跑道”位置，互不打擾：但是如果發(fā)現(xiàn)根本沒有條帶，一定要去檢查實(shí)驗(yàn)步驟是否有錯(cuò)誤，去查閱文獻(xiàn)，有可能你的目標(biāo)蛋白在你的樣本中根本不表達(dá)，或只有在特定條件下才表達(dá)。關(guān)于蛋白樣本提取：開始實(shí)驗(yàn)前問自己實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、液氮、器械準(zhǔn)備好了嗎？實(shí)驗(yàn)助手找好了嗎？請(qǐng)盡可能快速剪碎組織，剪得盡可能碎，這樣與裂解液充分接觸（記得稱重，根據(jù)樣本重量確定加入裂解液體積），提取出來的樣本才不會(huì)出現(xiàn)濃度過低的問題。樣本數(shù)量較多時(shí)盡量要有小伙伴合作，否則第一個(gè)和最后一個(gè)樣本相差時(shí)間太久，可能會(huì)導(dǎo)致提取效果不理想。如果只能自己提取樣本的話，盡量不要一次性提取太多數(shù)量的樣本，避免手忙腳亂哦。切記一定根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)施。關(guān)于免疫熒光染色：是以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)。孵育抗體時(shí)需要避光，注意阻水圈保持閉合，避免漏液；洗完切片盡量擦去阻水圈，注意不要碰到組織切片，否則可能前功盡棄。吸取封片甘油量根據(jù)組織切片大小適當(dāng)調(diào)整，放蓋玻片時(shí)注意不要留有氣泡等等。封片完成之后請(qǐng)立即拍片，如果時(shí)間不允許，可避光4℃暫放（最好不超過24小時(shí)，如果存放2-3天的經(jīng)歷，拍出來的效果可能不盡人意），放太久熒光會(huì)逐漸淬滅的。另外，免疫熒光染色一般可選擇染1種（下圖綠色UEA-1，DAPI染胞核不計(jì)入抗原種數(shù)）或2種抗原抗體結(jié)合物（綠色TIR和紅色MUC2，黃色視為二者共存），也可染3種及以上，但是要根據(jù)激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal laserscanning microscope）是否可以顯示相應(yīng)顏色來決定，一般染2種就可以了。如果加入多于1種的抗體，那么請(qǐng)注意區(qū)分兩種抗體的來源應(yīng)與樣本來源各不相同（例如，小鼠的結(jié)腸組織，不能使用小鼠來源的抗體，可以使用兔來源、驢來源或其他物種來源的抗體）。
7. 要有準(zhǔn)備意識(shí) 做到心中有數(shù)有些實(shí)驗(yàn)試劑需要現(xiàn)用現(xiàn)配，也就是說我們不能把所有材料都準(zhǔn)備好再做實(shí)驗(yàn)，需要在實(shí)驗(yàn)間隙準(zhǔn)備一些材料。那么作為實(shí)驗(yàn)新手，可能會(huì)出現(xiàn)下一步所需要的東西來不及準(zhǔn)備的情況。這就需要我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中有意識(shí)地去思考接下來的實(shí)驗(yàn)步驟，做到心中有數(shù)，才不會(huì)出現(xiàn)手忙腳亂的情況。無論哪一種實(shí)驗(yàn)，都應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性，不可人為改變實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)假設(shè)不一致時(shí)，應(yīng)遵循事物的客觀規(guī)律。有些結(jié)果可能由于實(shí)驗(yàn)操作過程出現(xiàn)一些問題導(dǎo)致其本身就是錯(cuò)誤的，應(yīng)多次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)然，由于個(gè)體差異，某些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)會(huì)偏低或偏高，可以排除差異較大的個(gè)體，但是不可以純粹為了驗(yàn)證假設(shè)，而有傾向地選取靠近假設(shè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，這是違背科學(xué)性原則的。9. 及時(shí)書寫實(shí)驗(yàn)記錄很多時(shí)候?qū)嶒?yàn)結(jié)果不好的原因往往可以從實(shí)驗(yàn)記錄中找到蛛絲馬跡，但它卻是經(jīng)常被忽略的。實(shí)驗(yàn)記錄的書寫應(yīng)該做到及時(shí)、真實(shí)、準(zhǔn)確、完整地記錄實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?shí)驗(yàn)材料（包括實(shí)驗(yàn)試劑及配制方法、儀器、樣本等）、實(shí)驗(yàn)過程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果、出現(xiàn)的問題（應(yīng)分析可能原因及解決辦法）和實(shí)驗(yàn)小結(jié)（簡(jiǎn)要總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和解釋，有助于指導(dǎo)后續(xù)研究）。每次實(shí)驗(yàn)還應(yīng)該記錄實(shí)驗(yàn)參與人、實(shí)驗(yàn)的日期和時(shí)間、以及實(shí)驗(yàn)條件（包括溫度、濕度等）。因此一定要按時(shí)及時(shí)地書寫實(shí)驗(yàn)記錄，以便在實(shí)驗(yàn)過程中追溯實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)并隨時(shí)查閱。做科研不是一簇而就的事情，不要期望只做一次實(shí)驗(yàn)就驗(yàn)證了假設(shè)或得到滿意的結(jié)果。前期可能會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問題，這是通向科研本身的必經(jīng)之路，沒有捷徑可言，而且要保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性，也必須多重復(fù)幾次，夯實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)論，最終的理論才更具說服力。保持一個(gè)樂觀的心態(tài)做實(shí)驗(yàn)是我們一直需要修煉的技能，實(shí)驗(yàn)虐我千百遍，我待實(shí)驗(yàn)如初戀。當(dāng)然，有些實(shí)驗(yàn)是就算重復(fù)N多次也不會(huì)有什么令人滿意的結(jié)果的，因?yàn)榭赡芤婚_始的方向就是錯(cuò)的。這就需要我們從知識(shí)儲(chǔ)備開始，立論假設(shè)就要嚴(yán)謹(jǐn)、認(rèn)真且全面，一定是閱讀了大量參考文獻(xiàn)和資料之后得出的研究方向和假設(shè)，要有立題依據(jù)，可以說查閱文獻(xiàn)資料在整個(gè)做實(shí)驗(yàn)階段是貫穿始終的。 各個(gè)實(shí)驗(yàn)都有或簡(jiǎn)單或復(fù)雜的步驟和技巧，但是核心原則和思想是相通的，以上分享的部分濕實(shí)驗(yàn)中所需要注意的一些細(xì)節(jié)和技巧，希望對(duì)生信分析過程中需要學(xué)習(xí)濕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證的小伙伴有所幫助。
|
