前言

文章題目：Microfluidics applications for high-throughput single cell sequencing
日期：2021-10-11
期刊：Journal of Nanobiotechnology
DOI：https:///10.1186/s12951-021-01045-6

摘要

細(xì)胞群體中單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性在疾病的發(fā)展和進(jìn)展中起著重要作用，但目前大多數(shù)傳統(tǒng)的基因分析方法掩蓋了單個(gè)細(xì)胞的差異。單細(xì)胞測(cè)序可以展示單個(gè)細(xì)胞的內(nèi)在異質(zhì)性，并揭示復(fù)雜和稀有的細(xì)胞群。近十年來，針對(duì)單細(xì)胞研究出現(xiàn)了不同的微流控技術(shù)，成為領(lǐng)域前沿。這篇綜述介紹了單細(xì)胞測(cè)序的過程，并回顧了用于單細(xì)胞測(cè)序的微流體原理，討論了常見的高通量單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及其優(yōu)缺點(diǎn)。

背景

單個(gè)細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。在相同的外部刺激或生理?xiàng)l件下，源自同一類型細(xì)胞的細(xì)胞可能會(huì)表現(xiàn)出細(xì)胞間差異。許多傳統(tǒng)研究，例如細(xì)胞分化和基因表達(dá)，都著眼于細(xì)胞群，這是多個(gè)細(xì)胞的“整體”表現(xiàn)。異質(zhì)性可以在看起來相同的細(xì)胞的形態(tài)、組成、功能和遺傳行為中出現(xiàn)，而對(duì)大量異質(zhì)細(xì)胞群的分析只能提供多個(gè)細(xì)胞的平均數(shù)據(jù)，從而丟失很多低豐度信息。為了解決這個(gè)困境，需要在單個(gè)細(xì)胞水平上分析細(xì)胞群。

2009年，湯富酬課題組首次報(bào)道了哺乳動(dòng)物單細(xì)胞的mRNA-seq全轉(zhuǎn)錄組分析方法；2011 年，Navin 等人首次實(shí)現(xiàn)了人類單個(gè)細(xì)胞的基因組測(cè)序，用來研究乳腺癌腫瘤細(xì)胞群的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化。近10年（2010-2020年）單細(xì)胞測(cè)序發(fā)展日新月異。

1990 年代初期，Manz 和Widmer 提出了微型化全化學(xué)分析系統(tǒng)（miniaturized total chemical analysis system, μTAS）的概念，使生物樣品的分析更加高效和靈敏。微流控技術(shù)作為 μTAS 的關(guān)鍵組成部分，已迅速發(fā)展成為生命科學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域的前沿研究方法。微流體，也稱為“芯片實(shí)驗(yàn)室”，是一種以簡(jiǎn)單有效的方式分析單個(gè)細(xì)胞的新型工具。

與傳統(tǒng)技術(shù)相比，微流體技術(shù)在分析樣品方面具有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)：

• 首先，微流控芯片的結(jié)構(gòu)和功能設(shè)計(jì)靈活，可以滿足單細(xì)胞分析的需求
• 其次，典型的微流體通道具有幾十到幾百微米的尺寸，可以處理從皮升到納升的溶液體積，從而減少樣品損失和高靈敏度，并使高通量單細(xì)胞分析成為可能
• 此外，多功能單元和微流控芯片的集成可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，防止人為操作產(chǎn)生的測(cè)量誤差

單細(xì)胞測(cè)序過程

主要過程包括單細(xì)胞分離、單細(xì)胞裂解、核酸擴(kuò)增、高通量測(cè)序、數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析

單細(xì)胞分離

與傳統(tǒng)測(cè)序方法不同，單細(xì)胞的分離是這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵，三個(gè)詞形容：fast, effective, and gentle

目前，分離單細(xì)胞樣品的方法包括有限稀釋、顯微操作、激光捕獲顯微切割（Laser capture microdissection, LCM）、熒光激活細(xì)胞分選（fluorescence activated cell sorters, FACS）和微流控技術(shù)。

• 有限稀釋主要使用手動(dòng)移液器或移液機(jī)器人來分離單個(gè)細(xì)胞，其每等份細(xì)胞數(shù)的概率服從泊松分布。這種方法已經(jīng)過時(shí)了，因?yàn)樗荒芘懦恍┬〖?xì)胞群
• 手動(dòng)細(xì)胞采摘的顯微操作通過結(jié)合顯微鏡和微量移液器，并應(yīng)用吸力來捕獲單個(gè)細(xì)胞，但是從顯微操作中獲得的細(xì)胞可能會(huì)受到機(jī)械損傷
• LCM 是一種先進(jìn)的工具，可在切片和染色處理后從大部分實(shí)體組織樣本中快速準(zhǔn)確地獲取單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞區(qū)室。該方法成功地保持了細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，并保留了空間位置信息
• FACS 系統(tǒng)通過在各種類型的流式細(xì)胞儀中用熒光標(biāo)簽標(biāo)記細(xì)胞的特定表面分子，細(xì)胞流快速通過激光束以提供光激發(fā)，然后下游的光檢測(cè)器用于捕獲具有特定信號(hào)的細(xì)胞， 具有高通量，在細(xì)胞分選方面非常有效
• 微流控是一種在微觀尺度上精確控制流體的新技術(shù)，具有體積小、樣品消耗少、反應(yīng)速度快、分選精度高、操作靈活等特點(diǎn)。微流體裝置具有多通道結(jié)構(gòu)，通道寬度從 10 到 100 μm 不等，使其能夠適應(yīng)每個(gè)單個(gè)細(xì)胞的大小和體積。大多數(shù)微流體設(shè)備使用以下微流體原理來隔離單個(gè)細(xì)胞：流體動(dòng)力學(xué)細(xì)胞陷阱、氣動(dòng)膜閥和基于油滴的隔離。目前最流行的微流體隔離方法是應(yīng)用微滴將單個(gè)細(xì)胞封裝在惰性載體油中，從而形成一個(gè)封閉空間，降低樣品污染的風(fēng)險(xiǎn)

單細(xì)胞裂解

常見的細(xì)胞裂解方法，如物理、化學(xué)和酶法

• 物理方法：目前主要存在三種主要的物理細(xì)胞裂解形式：機(jī)械、熱和電。機(jī)械裂解主要通過機(jī)械力分離細(xì)胞膜；熱裂解取決于細(xì)胞膜蛋白的熱誘導(dǎo)變性，需要額外的溫度循環(huán)；電裂解通過電場(chǎng)誘導(dǎo)的分子重新定向破壞細(xì)胞膜
• 化學(xué)細(xì)胞裂解應(yīng)用裂解緩沖液并誘導(dǎo)高效裂解以破壞細(xì)胞
• 酶促細(xì)胞裂解通常使用酶的組合來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的完全解離，這也是減少DNA斷裂的最溫和的方法?？梢允褂玫鞍酌?，如胃蛋白酶和胰蛋白酶

選擇最合適的裂解方法時(shí)需要考慮多種因素，包括細(xì)胞類型、下游分析、基因組 DNA (gDNA) 純化的難度

核酸擴(kuò)增

單個(gè)細(xì)胞中DNA或RNA等核酸的含量遠(yuǎn)低于測(cè)序所需的樣本量（哺乳動(dòng)物細(xì)胞中大約有 10 pg 的總 RNA），因此擴(kuò)增過程對(duì)于后續(xù)分析至關(guān)重要。

目前，常見的擴(kuò)增方法有兩種：全基因組擴(kuò)增（WGA）和全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增（WTA）。

• 目前可用的 WGA 方法包括簡(jiǎn)并寡核苷酸引發(fā)的聚合酶鏈反應(yīng) (DOP-PCR)、多重置換擴(kuò)增 (MDA) 和多重退火和循環(huán)擴(kuò)增循環(huán) (MALBAC)
• WTA 需要一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄過程來產(chǎn)生 cDNA 樣本。大約 10-20% 的 mRNA 在這個(gè)階段被逆轉(zhuǎn)錄。目前可用的 WTA 方法包括傳統(tǒng) PCR、改良 PCR、T7 體外轉(zhuǎn)錄 (T7-in vitro transcription, IVT) 和 Phi29 DNA 聚合酶介導(dǎo)的 RNA 擴(kuò)增

在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中，cDNA 擴(kuò)增從來都不是完全線性的，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中cDNA的濃度與實(shí)際不成比例。因此可以使用獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符 (unique molecular identifiers, UMI) 來標(biāo)記primary RNA 以減少擴(kuò)增偏差。

另外，測(cè)序前應(yīng)評(píng)估RNA的質(zhì)量，最常用的方法是Sanger測(cè)序，但研究表明droplet digital PCR (ddPCR) 具有更高的優(yōu)勢(shì)，它獨(dú)立于標(biāo)準(zhǔn)曲線和循環(huán)閾值（CT）值，大大提高了檢測(cè)微量核酸和稀有序列的靈敏度、特異性和精確度。

單細(xì)胞測(cè)序

目前主要有基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組的測(cè)序，幫助反映單細(xì)胞發(fā)育軌跡的基本構(gòu)成。

• 單細(xì)胞基因組測(cè)序，即scDNA-seq，揭示細(xì)胞基因組的突變和結(jié)構(gòu)變化，突出體細(xì)胞克隆結(jié)構(gòu)，追蹤疾病的進(jìn)化和傳播
• 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，即 scRNA-seq，可以以單細(xì)胞分辨率測(cè)量轉(zhuǎn)錄組中的基因表達(dá)，識(shí)別細(xì)胞簇中的生物學(xué)相關(guān)差異
• 單細(xì)胞表觀基因組測(cè)序側(cè)重于不改變 DNA 序列的表型的可遺傳變化，涉及 DNA 甲基化、染色質(zhì)可及性、組蛋白修飾和 DNA 折疊，反映基因組結(jié)構(gòu)變異如何影響細(xì)胞表型。其中單細(xì)胞亞硫酸氫鹽測(cè)序 (scBS-seq) 被用作 DNA 甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn)。

生成 scRNA-seq 文庫所需的常見步驟包括逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈 cDNA、合成第二鏈 cDNA 和 cDNA 擴(kuò)增 。在 scRNA-seq中，單個(gè)細(xì)胞中的所有轉(zhuǎn)錄本都通過逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)化為 cDNA，其中一些方法支持整個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，而另一些方法只允許對(duì)轉(zhuǎn)錄組的 5' 和 3' 末端進(jìn)行測(cè)序。例如，Smart-seq2 支持 cDNA 測(cè)序的全讀長覆蓋，F(xiàn)luidigm C1就可以自動(dòng)完成Smart-seq，可以執(zhí)行 96 次單細(xì)胞捕獲、裂解、逆轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴(kuò)增；Drop-seq、inDrop 和 10X Chromium 系統(tǒng)僅提供 cDNA 的 5' 或 3' 端的序列信息，因此不適用于可變剪接模式的分析。

單細(xì)胞測(cè)序的微流控原理

微流控芯片大致可分為三種技術(shù)原理：traps-based microfluidics, valves-based microfluidics, and droplet-based microfluidics

Traps-based microfluidics

如圖A，一個(gè)凹槽就是一個(gè)細(xì)胞”陷阱“，然后很多個(gè)陷阱會(huì)放在微流控芯片上，能夠高效捕獲單個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn)低，高達(dá) 97% 的陷阱可以捕獲單個(gè)細(xì)胞。陷阱的直徑取決于所研究細(xì)胞的大小。通過將陷阱直徑調(diào)整為樣本中的平均細(xì)胞大小，可以最大限度地減少多細(xì)胞情況。

Valves-based microfluidics

閥門用于隔離通道網(wǎng)絡(luò)的特定區(qū)域，允許生成反應(yīng)室并進(jìn)行獨(dú)立的反應(yīng)。閥門可以根據(jù)需要打開和關(guān)閉，從而允許復(fù)雜的操作?；陂y門的微流體系統(tǒng)允許在芯片上進(jìn)行自動(dòng)操作，有助于以高精度和控制準(zhǔn)確模擬細(xì)胞微環(huán)境的動(dòng)態(tài)。

微型閥門可分為主動(dòng)機(jī)械式、主動(dòng)非機(jī)械式、被動(dòng)機(jī)械式和被動(dòng)非機(jī)械式四大類。一般來說，主動(dòng)機(jī)械微閥因其最佳性能而最常用于微流體系統(tǒng)，而簡(jiǎn)單的被動(dòng)閥更適合實(shí)際應(yīng)用?；陂y門的微流體技術(shù)由 Quake 實(shí)驗(yàn)室于 2000 年首次開發(fā)，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模微流體集成和自動(dòng)化的突破。他們也利用 (Microfluidic large scale integration, mLSI) 技術(shù)在全自動(dòng)微流控芯片上分離 mRNA、合成 cDNA 和純化 DNA。

Droplet-based microfluidics

微滴技術(shù)可實(shí)現(xiàn)小樣本量的高通量篩選，可以應(yīng)用于單細(xì)胞水平的多種生物學(xué)檢測(cè)，包括單細(xì)胞培養(yǎng)、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析、數(shù)字PCR、RNA-seq ，抗體檢測(cè)，藥物遞送和篩選，毒性篩選和診斷。

微流控芯片上，液滴會(huì)隨著一種液相分離另一種不混溶的液體而產(chǎn)生?；谝旱蔚奈⒘黧w技術(shù)可以精確地操縱微通道中的流體，并通過注入載體油來封裝單個(gè)細(xì)胞，從而可以快速且一致地生成大小可控且均勻的液滴。基于液滴的微流體封裝單個(gè)細(xì)胞并提供理想的微反應(yīng)器，每個(gè)液滴在功能上相當(dāng)于微孔板中的一個(gè)孔，但反應(yīng)體積小一百萬倍。每秒可以產(chǎn)生數(shù)千個(gè)單獨(dú)的隔室，表面活性劑用于降低表面張力并防止液滴融合。此外，由于微反應(yīng)器的數(shù)量不受芯片物理尺寸的限制，液滴本質(zhì)上是可擴(kuò)展的。

液滴是通過使用兩種不混溶的流體，載體流體（ carrier fluid）和分散流體（dispersed fluid）產(chǎn)生的。

可以通過使用三種不同幾何形狀的微流體裝置實(shí)現(xiàn)液滴的生成，例如 T-junctions, flow focusing and co-flow

大量文獻(xiàn)表明，基于液滴的微流體技術(shù)已發(fā)展成為一種極好的單細(xì)胞培養(yǎng)方法。含有單個(gè)細(xì)胞的液滴可以在微流體裝置內(nèi)原位培養(yǎng)，甚至可以轉(zhuǎn)移用于芯片外培養(yǎng)。例如Wong等人開發(fā)了一種基于液滴的微流體技術(shù)，用于在癌細(xì)胞系或原發(fā)性腫瘤的細(xì)胞中進(jìn)行藥物篩選。通過這種方式，單個(gè)細(xì)胞分散在液滴中，并在藥物處理 24 小時(shí)內(nèi)成像以評(píng)估細(xì)胞活力 (Wong AHH, Li HR, Jia YW, Mak PI, Martins RPdS, Liu Y, et al. Drug screening of cancer cell lines and human primary tumors using droplet microfluidics. Sci Rep. 2017;7(1):9109.)

不過，液滴中細(xì)胞的封裝是隨機(jī)的，并且在很大程度上依賴于泊松統(tǒng)計(jì)，因此基于液滴的微流體技術(shù)可能會(huì)產(chǎn)生空液滴和包含多個(gè)細(xì)胞的液滴。研發(fā)人員可以通過優(yōu)化通道設(shè)計(jì)來最大限度地增加包含單個(gè)細(xì)胞的液滴數(shù)量，以提高單個(gè)細(xì)胞在生成液滴中的包裹率。

scRNA-seq測(cè)序方法比較

基于微孔板的 scRNA-seq 技術(shù)

這個(gè)技術(shù)依賴于將單個(gè)細(xì)胞捕獲或分選到管或多孔板中進(jìn)行單細(xì)胞分析。

• Smart-seq 旨在提高轉(zhuǎn)錄本讀取覆蓋率并增強(qiáng)對(duì)單核苷酸多態(tài)性的評(píng)估。相比之下，Smart-seq2 可以實(shí)現(xiàn)更多讀取甚至全長讀取覆蓋和更高的靈敏度，這被稱為 Smart-seq的升級(jí)版，并且可以提供有關(guān)基因突變、基因選擇性剪接和等位基因特異性表達(dá)的信息，廣泛用于單細(xì)胞全長 mRNA 分析。Fluidigm C1 是一個(gè)廣泛使用的商業(yè)平臺(tái)，它依賴于 Smart-seq ，可在單個(gè)芯片上為多達(dá) 800 個(gè)細(xì)胞提供自動(dòng)化的單細(xì)胞裂解、RNA 提取和 cDNA 合成。
• CEL-seq 是第一個(gè)在體外使用 cDNA 轉(zhuǎn)錄線性擴(kuò)增的方法，通過混合樣本并且使用barcode區(qū)分的方法克服了 RNA 起始量小的限制。不過只能用于 3' 端測(cè)序
• 此外，還有單細(xì)胞標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄測(cè)序（STRT-seq）、大規(guī)模平行RNA單細(xì)胞測(cè)序（MARS-seq）、單細(xì)胞RNA條形碼和測(cè)序（SCRB-seq）

基于微流控的 scRNA-seq 方法

目前最流行的高通量平臺(tái)是基于液滴的微流體，即微液滴，優(yōu)點(diǎn)包括低試劑和樣品體積，以及短細(xì)胞加載期。inDrop和 Drop-seq 于 2015 年首次應(yīng)用，使用特定的油來生成包含裂解緩沖液、barcode和細(xì)胞的液滴。細(xì)胞裂解后，條形碼寡核苷酸與釋放的 mRNA 的 poly(A) 雜交，確保文庫制備和測(cè)序。

• inDrop通過水凝膠微球引入寡核苷酸，在液滴中進(jìn)行細(xì)胞裂解和逆轉(zhuǎn)錄。水凝膠珠溶解在液滴中，釋放出寡核苷酸與 mRNA 雜交，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在液滴內(nèi)進(jìn)行。然而，inDrop 的主要缺點(diǎn)是細(xì)胞捕獲效率極低，每個(gè)細(xì)胞只能檢測(cè) 20-50 個(gè)轉(zhuǎn)錄本。Drop-seq 庫包含 1600 萬個(gè)條形碼，而 inDrop 技術(shù)僅產(chǎn)生約 150,000 個(gè)條形碼，這意味著 inDrop 每次運(yùn)行處理的細(xì)胞更少。適用于分析非常小的組織樣本，因?yàn)樗?Drop-seq 捕獲更高百分比的細(xì)胞。
• Drop-seq 傾向于使用條形碼珠（ barcoded beads），而 inDrop 則使用條形碼水凝膠微球（barcoded hydrogel microspheres）。條形碼珠包括了擴(kuò)增序列、barcode、UMI和捕獲單細(xì)胞 mRNA 分子的寡核苷酸 (dT) 序列。珠子連同附著的寡核苷酸和退火的 mRNA 都從液滴中釋放出來并組合到一個(gè)管中，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄
• 10X genomics使用Gel bead in EMulsion (GEM) 中封裝數(shù)千個(gè)單細(xì)胞，獲得的數(shù)據(jù)比 Drop-seq 質(zhì)量更高（在每個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到更多的基因并降低了技術(shù)噪音）