目前市場上的PCR產(chǎn)品主要是基于ABI開創(chuàng)的qPCR技術(shù)平臺和榮研化學(xué)開創(chuàng)的LAMP技術(shù)平臺，有的公司會在這兩個技術(shù)平臺的基礎(chǔ)上進(jìn)行研發(fā)創(chuàng)新，主要還是分成變溫和恒溫兩大類，而對于PCR的定量功能實現(xiàn)這塊，市場上的產(chǎn)品幾乎都是基于qPCR平臺實現(xiàn)對初始模板DNA分子的定量，但是如果將微流控芯片技術(shù)引入，PCR的定量就不局限于qPCR技術(shù)了~

PCR定量的理論基礎(chǔ)

視頻1：PCR擴(kuò)增原理視頻（來源【6】泛生子基因）

2）qPCR（實時熒光定量PCR）技術(shù)原理

實時熒光定量PCR技術(shù)主要通過兩種方式——熒光染料或者熒光標(biāo)記的探針對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，并結(jié)合相應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。

3）qPCR定量的數(shù)學(xué)理論模型

PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，成為定量的依據(jù)。

傳統(tǒng)的qPCR通常以循環(huán)閾值( cycle threshold,CT)為定量分析的基礎(chǔ),認(rèn)為在指數(shù)擴(kuò)增的開始階段樣品間的細(xì)小誤差尚未放大且擴(kuò)增效率恒定。對于一個PCR反應(yīng)，到達(dá)循環(huán)閾值時

其中，N₀為初始模板的拷貝數(shù)，N_t為第C_T個循環(huán)時產(chǎn)物的拷貝數(shù)，E為擴(kuò)增效率。將上式兩邊取對數(shù)，得到

對于一個特定的PCR反應(yīng),擴(kuò)增效率E和C_T個循環(huán)時的拷貝數(shù)N_t均為定值，因此C_T值與初始模板拷貝數(shù)N₀，的對數(shù)成反比關(guān)系^【5】。

PCR如何實現(xiàn)定量

1）定量PCR的幾種實現(xiàn)方式

定量PCR：以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過程進(jìn)行監(jiān)測，從而達(dá)到評估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行的，只有指數(shù)擴(kuò)增時期，CT值與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，且該值具有重現(xiàn)性。

表1：絕對定量與相對定量概述（來源：www.thermofisher.cn）

qPCR絕對定量和相對定量

1）絕對定量:精確的計算初始反應(yīng)的模板濃度(DNA,RNA)。

2）相對定量:相對定量用于分析特定樣品相對于參照樣品（比如，未處理的對照組）某個基因表達(dá)量的變化。

qPCR絕對定量（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）

圖1：對初始模板進(jìn)行定量分析（來源：先達(dá)基因官網(wǎng)）

qPCR相對定量

相對定量可根據(jù)從所有實時熒光定量 PCR 儀器獲取的數(shù)據(jù)而進(jìn)行。用于相對定量的計算方法有：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和比較 CT 法。

相對定量是測定在測試樣本中目標(biāo)核酸片段與校對樣本中同一序列片段的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。

圖2：比較CT法示意圖（圖源：線上）

如圖2實驗樣本和對照樣本都有擴(kuò)增曲線，都有相應(yīng)的CT值，Ct值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于實驗的質(zhì)量，Ct值是一個完全客觀的參數(shù)。Ct值越小，模板DNA的起始拷貝數(shù)越多；Ct值越大，模板DNA的起始拷貝數(shù)越少。正常的CT值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。PCR的理論擴(kuò)增效率是2^Ct，所以實驗樣本相對于對照樣本的擴(kuò)增倍數(shù)就等于2^ΔCt（實驗樣本擴(kuò)增曲線的CT值減去對照樣本的CT值）。

數(shù)字 PCR 絕對定量

圖3：數(shù)字 PCR 使用陽性（白色）與陰性（黑色）PCR 反應(yīng)的比例來計算目標(biāo)分子的數(shù)量（圖源：www.thermofisher.cn）

如圖3，數(shù)字PCR是一種核酸檢測和定量分析的新方法，可以作為傳統(tǒng)實時定量PCR的替代方法，以實現(xiàn)絕對定量及稀有等位基因的檢測。數(shù)字PCR的工作原理在于將DNA或cDNA樣品分割為許多單獨(dú)、平行的PCR反應(yīng)，部分這些反應(yīng)包含了靶標(biāo)分子（陽性），而其他不包含（陰性）。單個分子可以被擴(kuò)增一百萬倍或更多。在擴(kuò)增期間，TaqMan化學(xué)試劑及染料標(biāo)記探針可用于檢測特定序列的靶標(biāo)。當(dāng)不存在任何靶標(biāo)序列時，沒有信號累積。PCR分析后，陰性反應(yīng)片段用于生成樣品中靶標(biāo)分子的絕對計數(shù)，而無需標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)^【1】。  

數(shù)字PCR的數(shù)學(xué)理論模型

與傳統(tǒng)qPCR方法不同的是數(shù)字PCR采用直接計數(shù)的方法進(jìn)行定量分析,也就是在PCR擴(kuò)增結(jié)束后有熒光信號(產(chǎn)物)記為1,無熒光信號(產(chǎn)物)記為0,有熒光信號的反應(yīng)單元中至少包含一個拷貝的目標(biāo)分子。理論上,在樣品中的目標(biāo)DNA濃度極低的情況下,有熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)目等于目標(biāo)DNA分子的拷貝數(shù)。但是,在通常情況下,數(shù)字PCR的反應(yīng)單元中可能包含兩個或兩個以上的目標(biāo)分子,這時可以采用泊松概率分布公式( Poissondistribution)進(jìn)行計算。引用【5】數(shù)學(xué)模型公式：

n為反應(yīng)單元總數(shù),f為有熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)，m為樣品溶液的稀釋系數(shù)，c為樣品的原始拷貝數(shù)(濃度)。由上數(shù)學(xué)公式，根據(jù)反應(yīng)單元總數(shù)和有熒光信號的單元數(shù)以及樣品的稀釋系數(shù)，就可以得到樣本的最初拷貝數(shù)( 濃度) 。

數(shù)字PCR的定量方法不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值,因此不受擴(kuò)增效率的影響,也不必采用看家基因( housekeeping gene)和標(biāo)準(zhǔn)曲線,具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可以實現(xiàn)絕對定量分析^【5】。

（拓展問題）LAMP等溫擴(kuò)增的核酸檢測方法是否可以定量？

目前LAMP技術(shù)多用于定性實驗，也可通過濁度儀檢測副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，從而間接達(dá)到基因定量的目的,該方法所需濁度儀應(yīng)用范圍較窄，且儀器成本高。但LAMP并不是不能實現(xiàn)定量，查線上的文獻(xiàn)也發(fā)現(xiàn)有公司和科研機(jī)構(gòu)在做LAMP的熒光定量研究，原理上還是基于染料或者探針的熒光信號和擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)一定的數(shù)學(xué)關(guān)系而對樣本中的核酸分子進(jìn)行定量或者粗定量，感興趣的朋友可以學(xué)習(xí)文末參考項的【7】和【8】。

但是LAMP法如果應(yīng)用到數(shù)字PCR的液滴或者微流控芯片的微腔中，那也可以絕對定量，畢竟數(shù)字PCR定量不需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

微流控技術(shù)對于實現(xiàn)PCR的定量有什么優(yōu)勢？

微流控芯片相比較孔板這類傳統(tǒng)耗材有著微型化、自動化、多通量、極小樣本體積（數(shù)字PCR可達(dá)皮升級）以及密閉性的優(yōu)點(diǎn)，這也是為什么市場上的大多數(shù)POCT產(chǎn)品都免不了需要往微流控方向發(fā)展。對于PCR的定量功能實現(xiàn)，微流控技術(shù)會使得PCR定量的實現(xiàn)更加直觀直接。

圖4: DiaSorin 96 well Universal Disc（圖片源：DiaSorin官網(wǎng)）