流程圖：

首先，給大家展示一下本研究的流程圖，是不是看起來分析還是比較簡單呢？用的也就是我們平常常見的分析方法，但怎么樣就發(fā)到5分了呢？我們一起來看看吧。

結(jié)果

結(jié)果一：癌癥相關(guān)成纖維細胞（CAFs）豐度是一個與膀胱癌（BLCA）進展相關(guān)的預后因素

首先，作者利用MCP-counter算法計算了TCGA隊列中CAFs的豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境中，CAFs的豐度比其他類型的細胞都高（圖1a），并且與stromal store、immune score、ESTIMATE score顯著相關(guān)（圖1b）。并且，高水平的CAFs與BLCA患者的不良預后相關(guān)（圖1c）。作者還發(fā)現(xiàn)，CAFs與BLCA 臨床因素grade、stage、T classification、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（圖1d-g）。進一步用GEO隊列數(shù)據(jù)進行驗證，得到的結(jié)果與TCGA結(jié)果一致（圖2a-c），說明CAFs豐度是BLCA一個不良預后因素，且會促進BLCA的進展。

結(jié)果二：Hub基因篩選以及富集分析

根據(jù)CAFs中位值，將樣本分為高低CAFs組，篩選差異表達基因（DEGs）。在TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中共分別篩選到555和187個DEGs（圖3a-b）。WGCNA結(jié)果顯示，在TCGA隊列中，篩選出黃色模塊與CAFs顯著相關(guān)（圖3c）；在GEO隊列中，篩選到藍色模塊與CAFs顯著相關(guān)（圖3d）。進一步將TCGA和GEO隊列中篩選得到的DEGs和模塊基因取交集，得到的交集基因即作為hub基因。如圖4a所示，總共得到了74個hub基因（圖4a）。對得到的74個hub基因進行富集分析，結(jié)果顯示，這些基因涉及細胞外基質(zhì)重塑功能（圖4b-c）。

結(jié)果三：篩選與CAFs相關(guān)的關(guān)鍵基因

  在這里，對在TCGA和GEO隊列中篩選得到的hub基因進行單變量Cox回歸分析，結(jié)果顯示，在TCGA和GEO隊列中分別有22和10個基因與預后相關(guān)（圖4d-e），且發(fā)現(xiàn)兩個隊列中有3個基因重疊（圖4f），包括CALD1、COL18A1、TNC。作者在這里對這3個基因和CAFs的標志性基因進行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3個基因與這些標志性基因相關(guān)（圖4g）。在這里，作者后續(xù)以CALD1為主進行分析。GSEA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在hallmarkers基因集中，CALD1參與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和缺氧相關(guān)途徑（圖4h）；KEGG基因集中，CALD1參與多種微環(huán)境重塑途徑，以及免疫相關(guān)途徑（圖4i）。

結(jié)果四：CALD1、整體生存（OS）、臨床因素之間的關(guān)系，以及腫瘤微環(huán)境

在TCGA隊列，發(fā)現(xiàn)高表達CALD1與患者不良預后相關(guān)（圖5a）。為了驗證CALD1的預測性能，構(gòu)建了ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AUC值為0.679（圖5a）。再者，作者還發(fā)現(xiàn)，CALD1的表達水平與臨床因素stage、T、N classifications顯著相關(guān)（圖5a）。還發(fā)現(xiàn)，高CALD1的表達水平組中CAFs、巨噬細胞、stromal、immune、ESTIMATE scores相比于低CALD1的表達水平組都顯著升高（圖5b-c）。這些結(jié)果說明，CALD1可能通過CAFs和巨噬細胞共同調(diào)節(jié)BLCA基質(zhì)和免疫微環(huán)境。

結(jié)果五：腫瘤浸潤免疫細胞及免疫檢查點

利用CIBERSORT算法計算TCGA隊列中患者的22種免疫浸潤細胞比例（圖6a）。并且還發(fā)現(xiàn)，CALD1與巨噬細胞（M0，M2）顯著正相關(guān)，與CD8 T細胞顯著負相關(guān)（圖6b）。并且，比較了高低CALD1表達組22種免疫細胞的比例，同樣發(fā)現(xiàn)在高CALD1表達組，巨噬細胞（M0，M2）相對水平升高，CD8 T細胞相對水平降低（圖6c）。再者，作者還分析了高低CALD1表達組免疫檢查點相關(guān)基因的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的免疫檢查點相關(guān)基因在高CALD1表達組都是升高的（圖6d-e）。同時，作者還在GEO隊列中進行了驗證，結(jié)果與TCGA隊列結(jié)果基本一致（圖7a-e）。

結(jié)果六：臨床樣本驗證

為了驗證上述分析結(jié)果的準確性，作者收集了40份BLCA患者的樣本進行免疫組化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達的CALD1與BLCA高grade和stage相關(guān)（圖8a-b）。并且還發(fā)現(xiàn)，CALD1與CAFs的標志物ACTA2及M2巨噬細胞的標志物CD206共表達（圖8c）。結(jié)果表明，CALD1與CAFs和巨噬細胞相關(guān)，進而影響BLCA的進展。

總結(jié)：

怎么樣，一起看完這篇文章，有沒有發(fā)現(xiàn)其實分析思路也是比較簡單的，分析方法也比較常見，主要就是免疫浸潤 WGCNA，那怎么樣發(fā)到了5 呢？小編總結(jié)了一下本研究的幾點優(yōu)勢：第一，本研究從CAFs細胞出發(fā)，目的明確，不但一步步縮小范圍分析了在BLCA中與CAFs相關(guān)的關(guān)鍵基因，并且進一步分析了其中可能涉及的機制，可能與巨噬細胞相互作用，促進BLCA發(fā)展；第二，本研究用了3個獨立的數(shù)據(jù)集，其中包括臨床樣本，所以得到的結(jié)果更可靠、更有說服力。這個套路，也可以換成其他免疫細胞和其他類型的癌癥，可重復！快點行動起來吧~

文獻出處：

Du Y, Jiang X, Wang B, Cao J, Wang Y, Yu J, Wang X, Liu H. The cancer-associated fibroblasts related gene CALD1 is a prognostic biomarker and correlated with immune infiltration in bladder cancer. Cancer Cell Int. 2021 May 29;21(1):283. doi: 10.1186/s12935-021-01896-x. PMID: 34051818; PMCID: PMC8164301.