現(xiàn)象

原因

解決辦法

一抗二抗宿主不同

確定一抗是來自兔還是鼠，使用對應(yīng)二抗

組織中目的蛋白含量低

濃縮，放大信號

蛋白量不足

蛋白量在30-40ug中間，使用蛋白酶抑制劑設(shè)置陽性對照

轉(zhuǎn)膜不成功

減少電流，延長時間，多加5-10%甲醇溶液，活化PVDF膜

抗體濃度不合適

設(shè)置濃度梯度，根據(jù)結(jié)果選擇合適的濃度，調(diào)整孵育時間

洗膜時間過長

經(jīng)驗(yàn)值5次，每次5min，根據(jù)實(shí)際情況有所改變

一抗不識別待檢物種蛋白

對比免疫原序列和蛋白序列，確定抗體能與目的蛋白發(fā)生反應(yīng)

封閉時間過長目標(biāo)蛋白不顯色

減少封閉時間

疊氮鈉對二抗產(chǎn)生抑制

疊氮鈉不要和HRP標(biāo)記抗體一起使用

條帶背景過高

膜干燥

保證膜和充分的反應(yīng)液接觸

封閉時間不夠

延長封閉時間

抗體濃度過高

稀釋抗體并延長孵育時間

孵育溫度過高

4°C孵育

未結(jié)合蛋白沒有洗干凈

增加洗膜次數(shù)

出現(xiàn)雜帶

蛋白降解

加入蛋白酶抑制劑

一抗?jié)舛冗^高

降低一抗?jié)舛?/span>

二抗?jié)舛冗^高產(chǎn)生非特異結(jié)合

降低二抗?jié)舛?/span>

蛋白樣本具有多種修飾形式（乙?；?，糖基化，磷酸化等）

去修飾后驗(yàn)證

出現(xiàn)目的蛋白多聚體

增加樣品煮沸時間使蛋白充分解聚

細(xì)胞傳代多導(dǎo)致蛋白表達(dá)不同

未傳代細(xì)胞做對照

不是純化抗體

使用親和純化的抗體

背景有斑點(diǎn)

抗體結(jié)合封閉液導(dǎo)致黑色斑點(diǎn)

更換封閉液

轉(zhuǎn)膜時候有氣泡出現(xiàn)白色斑點(diǎn)

轉(zhuǎn)膜時用滾軸將氣泡趕出

抗體在膜上分布不均勻出現(xiàn)白色斑點(diǎn)

使用滾軸孵育，保持搖動

白條帶或者條帶有空斑

抗體濃度過高

降低抗體濃度

條帶“凹”形

電泳溫度高改變遷移速率和pH

4°C低溫電泳

膠冷卻不均勻

配膠時注意均勻

條帶“凸”形

凝膠和玻璃擋板底部有氣泡

配膠注意除氣泡

拖尾

蛋白了太大

調(diào)整蛋白量

一抗?jié)舛群蜁r間太長

減少一抗?jié)舛群蜁r間

含有較多非蛋白大分子雜質(zhì)

更換樣品

非均一性背景

膜干燥

保證膜和充分的反應(yīng)液接觸