高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，根據(jù)各物質(zhì)分配系數(shù)的差異，實(shí)現(xiàn)各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。

高效液相色譜劉路圖

高效液相色譜法（HPLC）具有其他色譜法無可比擬的優(yōu)勢(shì)，具有檢測(cè)速度快、分離效能高、檢測(cè)靈敏度高、選擇性好、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、藥品檢測(cè)和臨床分析等方面。流動(dòng)相、固定相是決定物質(zhì)能否被高效分離的關(guān)鍵因素。

一、影響流動(dòng)相的因素

1、pH 值的影響

流動(dòng)相的pH 值應(yīng)控制在２ ～ ７ 之間。當(dāng)pH值大于７ 時(shí)可使硅膠載體溶解；當(dāng)pH 值小于２ 時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系

統(tǒng)中需使用pH 值大于７ 的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑；當(dāng)需使用pH 值小于２ 的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑。

2、緩沖鹽的水相溶液的影響

含有緩沖鹽的流動(dòng)相應(yīng)盡可能少用，必須使用時(shí)，緩沖鹽的濃度應(yīng)盡可能低，否則容易阻塞管路。由于十八烷基鏈在純水相溶液中易產(chǎn)生彎曲，所以對(duì)于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中水相溶液的比例通常應(yīng)低于９５％ ，否則C１８ 鏈的隨機(jī)彎曲將引起組分保留值變化，導(dǎo)致色譜系統(tǒng)的重現(xiàn)性很差。

3、流動(dòng)相的組成比例、變化幅度的影響

流動(dòng)相的成份不能隨意改變，但是比例可適當(dāng)調(diào)整。每次調(diào)整流動(dòng)相組成比例時(shí)，以組分比例較低者（小于或等于５０％ ）相對(duì)改變量不超過± ３０％且絕對(duì)改變量不超過± １０％ 為宜，如４０％ 相對(duì)改變量的數(shù)值超過３０％ 時(shí)，則絕對(duì)改變量以± １０％為宜。

4、流動(dòng)相的保存期限

配好的流動(dòng)相都有一定的保存期限，因此為避免流動(dòng)相變質(zhì)而導(dǎo)致浪費(fèi)，建議根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況和有效期，合理配制一次所需的用量。在將配制好

的新鮮流動(dòng)相倒入儲(chǔ)液瓶前，需先將儲(chǔ)液瓶潤洗３次。然后把填寫好的《儲(chǔ)液瓶標(biāo)簽》（內(nèi)容包括流動(dòng)相成分、配比、配制人、配制日期及有效期等信息）粘貼到儲(chǔ)液瓶上。

二、影響色譜柱使用壽命的原因

1、 色譜柱篩板問題

篩板位于色譜柱的入口處，容易發(fā)生堵塞。篩板堵塞會(huì)產(chǎn)生柱壓升高、色譜峰拖尾、塔板數(shù)降低等問題。樣品中含有微粒是導(dǎo)致篩板堵塞的主要原因。因此，為了避免此類問題的發(fā)生，必須在進(jìn)樣前將樣品過0.45μm 的濾膜。

2、 強(qiáng)保留樣品組分

強(qiáng)吸附性的樣品組分吸附在柱頭填料上，能嚴(yán)重地縮短色譜柱壽命。分析生物組織或體液（如血漿）的提取物、含油劑等復(fù)雜樣品時(shí)，這種滯留組分的影響尤其嚴(yán)重。色譜柱應(yīng)用中，色譜峰嚴(yán)重拖尾或分叉的出現(xiàn)往往是強(qiáng)保留污染物在柱頭吸附的體現(xiàn)。在進(jìn)樣閥與色譜柱之間加／支保護(hù)性的小預(yù)柱，能夠有效減少強(qiáng)吸附組分對(duì)色譜柱的污染。小預(yù)柱通常為填充良好的1~2cm 的短柱，內(nèi)裝有與色譜柱相當(dāng)?shù)奶盍?。需要注意的是小預(yù)柱必須定期更換。

色譜柱分離過程

3、反相色譜柱的清洗與再生

常規(guī)樣品污染的硅膠基質(zhì)色譜柱，一般選用溶劑強(qiáng)度逐漸增大（極性逐漸減弱）的溶劑清沖洗，強(qiáng)疏水性的溶劑清洗非極性物質(zhì)，如脂類。最常用的方法是用２０ 倍柱體積（柱體積指色譜柱內(nèi)空腔體積，４.６x２５０mm 色譜柱的柱體積為４.２mL）的乙腈（或甲醇） ∶ 水＝ ９０ ∶ １０（V／V） → 乙腈→ 二氯甲烷→ 乙腈→ 乙腈（或甲醇） ∶ 水＝ ９０ ∶ １０ （V／V）沖洗色譜柱。需要注意的是在清洗和再生的過程中，需要保證每種清洗溶劑和下一種清洗溶劑互溶。當(dāng)金屬離子污染色譜柱后，必須使用特殊的溶劑（磷酸和０.１mol／L 檸檬酸）清洗色譜柱，才能得到再生。

4、正相色譜柱的清洗與再生

正相色譜柱的清洗與再生的方法與反相色譜柱相反，用極性逐漸增強(qiáng)的溶劑沖洗。常用的方法正己烷→ 異丙醇→ 二氯甲烷→ 甲醇→ 二氯甲烷→異丙醇→ 正己烷沖洗，每種溶劑不少于２０ 倍柱體積。