【原】全長轉錄組分析之牛津納米孔測序介紹

健明 2021-07-14

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同樣的，因為生信技能樹90%教程出自我本人，所以基本上我還沒有涉獵到的項目就不太可能有教程，甚至該領域中文教程幾乎是空白。好在我交友還算比較廣，所以邀請了不同系列專欄作者投稿到生信技能樹發(fā)布他們的筆記！

有點類似于生信菜鳥團的專欄作者，但是又不太一樣

（一）測序基本原理以及原始下機數(shù)據簡介

個人所知有限，如有理解錯誤，還請批評指正。

ONT全稱Oxford Nanopore Technologies，直譯就是牛津納米孔技術，是三代測序平臺中一種。公司官網為https:///。

此次專題主要學習和記錄一些在分析ONT測序產品如ONT全長轉錄組，ONT甲基化以及ONT重測序中的所思所想所得。

官網給出其技術優(yōu)點的廣告如下：Nanopore sequencing, the only technology that offers:

Direct sequencing of native DNA/RNA, or samples that have been amplified with PCR/other methods
REAL Real-time
No capital cost required
Read any length of DNA/RNA - short to ultra-long
Scalable to portable or desktop
Simple & rapid, or automated, library prep
High yields for large genomes

總結就是：

1.單分子測序：納米孔每次只通過一個堿基

2.測序讀長長：相比于二代測序最常見的150bp，三代ONT全長轉錄組平均讀長為1-1.5kb(分析項目經驗值)，最長讀長約為10-20kb

3.測序速度快：不同系列時間有差異。

4.測序數(shù)據實時監(jiān)控，機器方便攜帶等。

應用范圍一張圖概括：

1.測序儀種類

主要根據測序數(shù)據產出的不同分為以下幾種平臺，每個平臺下還有不同的型號：

MinION

MinlON

ONT最知名產品，僅有U盤大小，插入普通PC電腦即可運行，一次可運行一個flow cells，產出約10-30Gb的測序數(shù)據，運行時長約48小時；

Flongle

MinION和GridION X5測序儀的適配器（adapter，flow cell dongle），僅供一次性使用。不同于MinION流動槽含有512個通道，F(xiàn)longle含有126個通道。它目前最多能生成1.8 Gb數(shù)據。

PromethION

PromethlON

PromethION是ONT推出的最新款超高通量測序設備，它支持實時、長讀長、直接DNA和RNA測序工作流程。一次可運行24 (PromethION 24) 到48 (PromethION 48) 個測序芯片，按照每張測序芯片包含3,000個納米孔通道，所有芯片同時運行將可產出高達7.6Tb甚至是15Tb的數(shù)據，這能夠滿足超高通量的、快速周轉測序需求。適用于大規(guī)模群體遺傳學研究和大型動植物基因組測序項目；

GridION

GridlON

GridION X5系統(tǒng)的測序部分包含五個 flow cells，這些flow cells可單獨使用或協(xié)同使用，并通過USB連接到計算機。利用現(xiàn)有的試劑和軟件每運行48小時可生成高達150GB的測序數(shù)據。GridION X5的出現(xiàn)填補了MinION和PromethION之間的空白。

2.測序基本原理

簡單概括：基于納米孔的單分子實時電信號測序技術。

詳細一點：DNA/RNA雙鏈在馬達蛋白的帶領下與鑲嵌在生物膜上的納米孔蛋白結合并解螺旋，在生物膜兩側電壓差的作用下，DNA/RNA鏈以一定的速率通過納米孔通道蛋白。由于DNA/RNA鏈上不同堿基化學性質存在差異，所以當單個堿基通過納米孔通道時，會引起不同電學信號的變化。根據電流的大小及電流大小的變化情況，通過“遞歸神經網絡（Recurrent Neural Network）”的復雜算法對堿基進行判讀，即可計算獲得相應堿基的類型，完成序列的實時測定。

測序原理示意圖：

ONT_principle

測序原理參考文獻：

Three decades of nanopore sequencing
Nanopore sequencing data analysis: state of the art, applications and challenges
The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community
Systematic and stochastic influences on the performance of the MinION nanopore sequencer across a range of nucleotide bias

3.原始下機數(shù)據簡介

原始下機數(shù)據根據前期實驗建庫時混樣與非混樣建庫稍微有些區(qū)別