HOMER 是一套用于Motif查找和二代數(shù)據(jù)分析的工具。HOMER 中的工具是使用Perl 和C++編寫(xiě)的，是Linux command line based。HOMER 這個(gè)軟件是一個(gè)大雜燴，能解決幾乎所有的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析。（這里，我們僅僅是介紹Motif查找這個(gè)功能）

1.HOMER軟件安裝和配置

configureHomer.pl配置Homer的語(yǔ)法是：（下一節(jié)講具體應(yīng)用）

我們看下這些options都有哪些：

-list 列出可用的包
-install 安裝homer需要用到的數(shù)據(jù)包
-version 安裝homer包時(shí)，可以指定包版本
-remove 移除包
-update 更新所有包到最新版本
-reinstall 強(qiáng)制重新安裝所有已經(jīng)安裝過(guò)的包
-all 安裝所有包
-getFacts (add humor to HOMER - to remove delete contents of data/misc/)
-check 檢查第三方軟件：samtools, DESeq2, edgeR
-make 重新配置和編譯可執(zhí)行文件
-sun SunOS系統(tǒng)，使用gmake 和 gtar代替make 和 tar
-keepScript 不更新configureHomer.pl
-url 安裝時(shí)，使用的資源地址，默認(rèn)：http://homer./homer/
 Hubs & BigWig settings (with read existing settings from config.txt if upgrading):
-bigWigUrl  (Setting for makeBigWigs.pl)
-bigWigDir  (Setting for makeBigWigs.pl)
-hubsUrl  (Setting for makeMultiWigHub.pl)
-hubsDir  (Setting for makeMultiWigHub.pl)
 Configuration files: 下載 update.txt，更新config.txt

2. HOMER包介紹和安裝

homer包分為4種：

• SOFTWARE：homer工具包，包含一些常用數(shù)據(jù)。

• ORGANISMS：物種特異性的數(shù)據(jù)，包含Gene accession, gene descriptions, and GO analysis信息。大多數(shù)數(shù)據(jù)來(lái)自于NCBI Gene database。下載promoter 或 genome 數(shù)據(jù)時(shí)，會(huì)自動(dòng)下載對(duì)應(yīng)Organism 包。

• PROMOTERS：Promoter 序列信息和Promoter 富集分析的文件。大多數(shù)數(shù)據(jù)來(lái)自RefSeq transcript。

• GENOMES：基因組序列及其注釋信息。

這里需要特別注意下：雖然conda安裝好了Homer，但并沒(méi)有包含參考序列或注釋數(shù)據(jù) 。所以需要使用 configureHomer.pl下載各種數(shù)據(jù)包。

下載數(shù)據(jù)之前先查看數(shù)據(jù)列表，看Homer已經(jīng)有哪些數(shù)據(jù)包：

如上述介紹，Homer數(shù)據(jù)包安裝使用-install參數(shù)

3.利用ChIP-Seq結(jié)果在基因組區(qū)域中尋找富集的Motifs

homer軟件在讀取bed文件時(shí)，需要提取對(duì)應(yīng)的列作為輸入文件。我們要對(duì)MACS找到的peaks記錄文件，還需提取對(duì)應(yīng)的列給HOMER作為輸入文件，提取操作為：

不理解沒(méi)關(guān)系，我們拿我跑的chipseq數(shù)據(jù)做示范，看awk對(duì)bed文件做了什么。
使用命令less -S ChIP-Seq_H3K4Me3_1_trimmed_rmdup_summits.bed 看下awk處理之前bed文件長(zhǎng)什么樣子：

使用awk對(duì)bed文件進(jìn)行處理，處理完的文件命名為ChIP-Seq_H3K4Me3_1_homer.bed

把bed文件變成這個(gè)樣子，用于Homer軟件的讀取,我們稱(chēng)這樣的文件叫做 Homer Peak/Positions file
我們可以看到Homer Peak/Positions file有4列：

• 第一列: 染色體

• 第二列: 起始位置

• 第三列: 終止位置

• 第四列: 鏈的方向(+/- or 0/1, where 0="+", 1="-")

findMotifsGenome.pl命令用于在基因組區(qū)域中尋找富集Motifs
命令使用格式：

使用實(shí)例：尋找我們剛剛生成的Homer Peak/Positions file文件：ChIP-Seq_H3K4Me3_1_homer.bed的 motif 使用命令：

上述命令（找motif）每一樣品需要運(yùn)行30-40分鐘后，得到文件夾ChIP-Seq_H3K4Me3_1_motifDir,文件夾里的內(nèi)容有：

其中會(huì)生成一個(gè)詳細(xì)版的網(wǎng)頁(yè)結(jié)果，生成這些文件的具體作用下節(jié)講述

常用參數(shù)：
 -bg：自定義背景序列；
 -size: 用于motif尋找得片段大小，默認(rèn)200bp；-size given 設(shè)置片段大小為目標(biāo)序列長(zhǎng)度；越大需要得計(jì)算資源越多；
 -len：motif大小設(shè)置，默認(rèn)8,10,12；越大需要得計(jì)算資源越多；
 -S：結(jié)果輸出多少motifs, 默認(rèn)25；
 -mis：motif錯(cuò)配堿基數(shù)，默認(rèn)2bp；
 -norevopp：不進(jìn)行反義鏈搜索motif；
 -nomotif：關(guān)閉重投預(yù)測(cè)motif；
 -rna: 輸出RNA motif，使用RNA motif數(shù)據(jù)庫(kù)；
 -h：使用超幾何檢驗(yàn)代替二項(xiàng)式分布；
 -N：用于motif尋找得背景序列數(shù)目，default=max(50k, 2x input)；耗內(nèi)存參數(shù)

使用實(shí)例：注釋ChIP-Seq_H3K4Me3_1_homer.bed的 peaks 使用命令：

4.HOMER Motif 分析基本步驟和結(jié)果分析

Homer主要被用于 ChIP-Seq 分析，但是核酸序列motif尋找問(wèn)題都可以嘗試使用。

注意：這里大部分是在介紹Homer軟件背后是怎么工作的，不是說(shuō)我們?cè)谑褂肏omer軟件找motif時(shí)的步驟，我們使用的時(shí)候直接調(diào)用Homer軟件的內(nèi)部命令就好

 一  提取序列
提供的數(shù)據(jù)是基因組位置信息，就需要提取對(duì)應(yīng)的DNA信息；提供基因號(hào)時(shí)，需要選擇啟動(dòng)子區(qū)域。對(duì)應(yīng)著就是我們前面用awk 處理bed文件，最后得到要求的那四列。
 二  背景選擇
未指定背景序列時(shí)，HOMER 會(huì)自動(dòng)選擇。（上面chipseq處理的時(shí)候就沒(méi)有指定背景序列）
對(duì)基因組某些區(qū)域進(jìn)行分析時(shí)，從基因組隨機(jī)選擇GC含量一致的序列作為背景序列。
對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行分析時(shí)，除用來(lái)分析外的所有啟動(dòng)子將被作為背景。
自定義背景使用參數(shù)-bg
 三  GC 標(biāo)準(zhǔn)化
目標(biāo)序列（對(duì)應(yīng)著上面的就是Homer Peak/Positions file）和背景序列會(huì)基于GC含量按5%作為bin 查看GC含量的分布。背景序列會(huì)得到權(quán)值，從而使得其GC含量分布與目標(biāo)序列一致。
ChIP-Seq 實(shí)驗(yàn)得到序列GC含量。
 四  自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化
需要分析的序列除了GC含量會(huì)帶來(lái)誤差，其他的生物學(xué)現(xiàn)象，外顯子中密碼子偏好性或測(cè)序?qū)嶒?yàn)中偏好性都會(huì)影響分析。對(duì)于足夠強(qiáng)的偏差，HOMER 會(huì)自動(dòng)追蹤目標(biāo)序列和背景中顯著差異的特征序列，并通過(guò)調(diào)整背景序列的權(quán)重來(lái)平衡輸入數(shù)據(jù)和背景中短寡聚核酸序列不平衡。
 短寡聚核酸序列長(zhǎng)度可以通過(guò)參數(shù)-nlen <#>指定。

默認(rèn)情況下，HOMER 調(diào)用homer2 進(jìn)行motif 分析；通過(guò)參數(shù)"-homer1" 可以指定老版本工具。

 一  將輸入序列解析為寡聚核苷酸序列
將輸入序列按照motif 長(zhǎng)度期望值解析為寡聚核苷酸序列，以及創(chuàng)建Oligo 數(shù)據(jù)表。Oligo 數(shù)據(jù)表中記錄著每條oligo 在目標(biāo)序列和背景中被發(fā)現(xiàn)的次數(shù)。
 二  Oligo 自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化
 三  全局搜索階段
 Oligo 表格信息構(gòu)建好之后，HOMER 對(duì)富集的Oligo 進(jìn)行全局搜索。如果一個(gè)Motif是富集的，那么屬于這個(gè)Motif的Oligo 也應(yīng)該會(huì)富集。首先，HOMER 會(huì)搜索可能富集的Oligo 。HOMER 允許錯(cuò)配 。
使用參數(shù)-mis <#> 調(diào)節(jié)允許的錯(cuò)配數(shù)目
 四  Mask and Repeat
 當(dāng)最優(yōu)oligo被優(yōu)化成motif后，motif 對(duì)應(yīng)的序列從要分析的數(shù)據(jù)中移除，接下來(lái)再分析最優(yōu)的…..直到 25(默認(rèn)值，"-S <#>")個(gè)motifs 被發(fā)現(xiàn)。
比如，我們這里處理chipseq時(shí)的情況

 五   計(jì)算已知Motifs是否富集

為了搜索輸入數(shù)據(jù)中已知Motifs ，HOMER 可以輸入已知Motifs 數(shù)據(jù)，可以使用HOMER 默認(rèn)的 ("data/knownTFs/known.motifs")，也可以是自己構(gòu)建("-mknown") 。

3.5.2 篩選每一個(gè)Motif

對(duì)于每個(gè)motif，HOMER 計(jì)算豐度（包含motif的序列/background sequences）， ZOOPS (zero or one occurence per sequence)計(jì)數(shù)以及使用超幾何檢驗(yàn)或二項(xiàng)式計(jì)算顯著性。

我們chipseq，找motif的輸出文件如下圖：

這些輸出結(jié)果包括：

4.3.1 Motif Files

文件包含motifs的信息

"*.motif"文件格式：

一個(gè)motif 的信息分為一塊。motif 信息首行是motif 各種統(tǒng)計(jì)信息；其他行對(duì)應(yīng)各個(gè)A/C/G/T的占比。

motif 信息首行解析：

1. ">" + 序列 (可能是空白) example: >ASTTCCTCTT

2. Motif 名字 example: 1-ASTTCCTCTT or NFkB

3. 檢測(cè)閾值對(duì)數(shù)值 example: 8.059752

4. 富集P-value對(duì)數(shù)值 example:  -23791.535714

5. 0 用于老版本格式的占位符

6. T:17311.0(44.36%),B:2181.5(5.80%),P:1e-10317

7. T:#(%) - 包含motif的目標(biāo)數(shù)據(jù)序列數(shù)除以目標(biāo)數(shù)據(jù)序列總數(shù)

8. B:#(%) - 包含motif的背景序列數(shù)除以背景序列總數(shù)

9. P:# - 富集 p-value

10. 用逗號(hào)分隔Motif統(tǒng)計(jì)量, example: Tpos:100.7,Tstd:32.6,Bpos:100.1,Bstd:64.6,StrandBias:0.0,Multiplicity:1.13

11. Tpos: motif在目標(biāo)序列中的平均位置 (0 = start of sequences)

12. Tstd:  motif在目標(biāo)序列中位置的標(biāo)準(zhǔn)偏差

13. Bpos: motif在背景序列中的平均位置 (0 = start of sequences)

14. Bstd:   motif在背景序列中位置的標(biāo)準(zhǔn)偏差

15. StrandBias: log ratio of + strand occurrences to - strand occurrences.

16. Multiplicity: 具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的序列中每個(gè)序列的平均出現(xiàn)次數(shù)

4.3.2重頭預(yù)測(cè)(de novo)的 motif
首先會(huì)對(duì)motif進(jìn)行去冗余，將每個(gè)motif 的概率矩陣轉(zhuǎn)換為向量，求motif之間的Pearson 相關(guān)性。 HTML 結(jié)果：

表格中，Best Match/Details項(xiàng)中：
More Information：與預(yù)測(cè)的motif相似的的已知motifs
Similar Motifs Found：與預(yù)測(cè)的motif相似的的其它預(yù)測(cè)motifs

4.3.3 已知 motif 的富集情況(knownResults.html)

參考資料：
 1.http://homer./homer/ngs/peakMotifs.html
 2.https://www.jianshu.com/p/1384173c353b
 3.https://www.jianshu.com/p/4af579b2e532
 4.https://www.jianshu.com/p/2bf020cc8f90
 5.https://www.jianshu.com/p/1602c2621c2b
 6.https://www.jianshu.com/p/1602c2621c2b