| 1. | 解凍試劑盒 |
以下說明描述如何使用室溫水槽解凍試劑盒。 注意：您也可以在2 ℃到8 ℃的儲(chǔ)藏溫度下整夜解凍試劑。儲(chǔ)藏在此溫度下的試劑最長穩(wěn)定時(shí)間為一周。 |
| a. | 從-25 ℃到-15℃的儲(chǔ)藏溫度中取出試劑盒。 |
| b. | 將試劑盒放入裝有足量室溫去離子水的水槽中，淹沒試劑盒底部。請(qǐng)勿使水超過試劑盒上打印的最高水位線。 |
| 最高水位線
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| c. | 讓試劑盒在室溫水槽中解凍，直至其完全解凍。 |
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| d. | 從水槽中取出試劑盒，然后在工作臺(tái)上輕輕拍打試劑盒，去除其底部的水分。讓試劑盒底部變干。 |
| 2. | 變性和稀釋文庫 |
| 根據(jù)您的文庫類型需要，稀釋文庫并使其變性，然后添加可選的 PhiX 對(duì)照品（此步驟可在解凍試劑盒期間進(jìn)行，以節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間）。 |
| 3. | 清洗流動(dòng)槽 |
| a. | 戴上一副新的無粉手套，使用塑料鑷子夾住流動(dòng)槽的塑料盒底部，將它從流動(dòng)槽容器中取出來。 |
| 取出流動(dòng)槽 | 
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| b. | 用實(shí)驗(yàn)室級(jí)用水輕輕沖洗流動(dòng)槽，直至完全沖洗掉玻璃盒和塑料盒上多余的鹽。 注意：殘余的鹽分會(huì)影響流動(dòng)槽在儀器上的放置。如果鹽分在成像區(qū)域變干，成像也會(huì)受到影響。 |
| 沖洗流動(dòng)槽 | 
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| c. | 小心清潔黑色流動(dòng)槽端口墊，使用無絨棉巾紙徹底擦干流動(dòng)槽和小盒，輕輕拍干墊片和相鄰玻璃區(qū)域。 |
| 流動(dòng)槽端口和墊片 | 
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| d. | 使用酒精棉清潔流動(dòng)槽玻璃。確保玻璃上沒有條痕、指印以及線頭或組織纖維。 |
| 注意：請(qǐng)勿在流動(dòng)槽端口墊上使用酒精棉。 |
| 擦干流動(dòng)槽 | 
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| e. | 用無絨棉巾紙擦干多余的酒精。 |
| f. | 確保流動(dòng)槽端口中沒有阻塞物且墊片在流動(dòng)槽端口周圍位置正確。如果墊片看起來離開原位，請(qǐng)輕輕按回使其安全地置于流動(dòng)槽端口周圍。 |
| 4. | 檢查試劑盒 |
| a. | 將試劑盒翻轉(zhuǎn)十次以混勻解凍的試劑，然后檢查所有位置是否均已解凍。 |
| b. | 檢查位置1、2和4處的試劑以確保其充分混勻且沒有沉淀。 |
| c. | 在工作臺(tái)上輕輕拍打試劑盒以減少試劑中的氣泡。 |
| 注意：MiSeq吸管會(huì)伸到每個(gè)槽的底部以吸入試劑，因此請(qǐng)務(wù)必確保槽中沒有氣泡。 |
| d. | 將試劑盒放在冰上長達(dá)6個(gè)小時(shí)或置于2℃到8℃的溫度下，直到準(zhǔn)備好設(shè)置運(yùn)行。為獲得最佳結(jié)果，請(qǐng)立即裝入樣品并設(shè)置運(yùn)行。 |
| 注意：這組試劑包含甲酰胺，這種脂肪酰胺可能是一種生殖毒素。吸入、攝取、皮膚接觸和眼睛接觸都會(huì)對(duì)身體造成傷害。請(qǐng)穿戴防護(hù)裝備，包括護(hù)目用具、手套和實(shí)驗(yàn)室工作服。將已使用的試劑作為化學(xué)廢物處理，并且遵循當(dāng)?shù)卣踩珮?biāo)準(zhǔn)丟棄已使用的試劑。 |
| 5. | 裝入樣品文庫 |
| a. | 當(dāng)試劑盒完全解凍且可供使用時(shí)，您即可將已制備的文庫裝入試劑盒。 |
| b. | 使用無塵實(shí)驗(yàn)室紙巾將標(biāo)記有Load Samples（裝入樣品）的槽封箔口擦拭干凈 |
| c. | 使用潔凈的 1mL 移液器刺穿封箔。 |
| d. | 將 600 μL 的已制備文庫注入Load Samples（裝入樣品）槽，避免接觸封箔。 |
| 裝入文庫 | 
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| e. | 使用MiSeq控制軟件(MCS)界面直接繼續(xù)執(zhí)行運(yùn)行設(shè)置步驟。 |
| 6. | 使用 MCS 設(shè)置運(yùn)行 |
| a. | 從“Home（主頁）”屏幕，選擇Manage Instrument（管理儀器）。 |
| b. | 選擇Reboot（重新啟動(dòng)），重新啟動(dòng)系統(tǒng)軟件。 |
| c. | [可選] 從“Run Options（運(yùn)行選項(xiàng)）”屏幕中，查看配方、樣品表、清單和MiSeqOutput文件夾的文件夾位置。 |
| d. | 從“Home（主頁）”屏幕中，選擇Sequence（測(cè)序），開始運(yùn)行設(shè)置步驟。 
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| 6.1 | Load Flow Cell（裝入流動(dòng)槽） |
| a. | 抬起流動(dòng)槽倉門，然后按流動(dòng)槽鎖右側(cè)的釋放按鈕。流動(dòng)槽鎖打開。 |
| 打開流動(dòng)槽鎖 | 
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| b. | 確保流動(dòng)槽臺(tái)是不起毛的。如果存在污垢，請(qǐng)使用酒精棉或者蘸了乙醇或異丙醇的無絨紙巾擦拭流動(dòng)槽臺(tái)。仔細(xì)擦拭流動(dòng)槽臺(tái)面，直到其徹底干燥清潔。 |
| c. | 手持流動(dòng)槽邊緣，將流動(dòng)槽放置在流動(dòng)槽臺(tái)上。 |
| 將流動(dòng)槽放入流動(dòng)槽臺(tái) | 
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| d. | 輕輕按下流動(dòng)槽鎖以將其在流動(dòng)槽上關(guān)閉。當(dāng)流動(dòng)槽鎖關(guān)閉時(shí)，定位銷會(huì)固定流動(dòng)槽。流動(dòng)槽鎖鎖定時(shí)，會(huì)發(fā)出咔噠聲。 |
| 關(guān)閉流動(dòng)槽鎖 | 
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| e. | 關(guān)閉流動(dòng)槽倉門。 |
| f. | 選擇 Next（下一步）。
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| 6.2 | Load Reagents（裝入試劑） |
| a. | 將PR2瓶從2℃到8℃的儲(chǔ)藏環(huán)境中取出。翻轉(zhuǎn)混勻，然后取下蓋子。 |
| b. | 打開試劑倉門，拉起吸管手柄直到其鎖定到位。 |
| c. | 取出清洗瓶并裝入 PR2 瓶。 |
| 裝入PR2 |
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| d. | 將廢水瓶中的液體全部倒入相應(yīng)的廢水容器中。 |
| e. | 慢慢降低吸管手柄。確保吸管插入到 PR2 瓶和廢水瓶中。 |
| 降低吸管手柄 |
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| f. | 選擇 Next（下一步）。 |
| g. | 打開試劑冷卻器門，取出清晰槽。 |
| 注意：請(qǐng)勿將試劑冷卻器門打開過長的時(shí)間。 |
| h. | 握住試劑盒帶有Illumina標(biāo)簽的一端將試劑盒滑入試劑冷卻器直到其卡住。 |
| 裝入試劑盒 |
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| i. | 關(guān)閉試劑冷卻器門。 |
| 注意：如果試劑盒與流動(dòng)槽不兼容，則會(huì)顯示一條消息。選擇 Back（返回），裝入兼容的試劑盒，或選擇 Exit（退出），返回“Home（主頁）”屏幕。 |
| j. | 關(guān)閉試劑倉門，選擇Next（下一步）。
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| k. | 選擇樣品表(Sample Sheet預(yù)先根據(jù)建庫信息制作并放入指定文件夾目錄中）。 |
| 6.3 | Review（審核） |
裝入流動(dòng)槽和試劑后，在啟動(dòng)運(yùn)行之前應(yīng)查看運(yùn)行參數(shù)并執(zhí)行運(yùn)行前檢查。
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| a. | 查看實(shí)驗(yàn)名稱、分析工作流程和片段長度。這些參數(shù)事先在樣品表中指定。 |
| b. | 在左下角查看文件夾位置。如需做出任何更改，請(qǐng)選擇Change Folders（更改文件夾）。完成更改后，請(qǐng)選擇Save（保存），然后選擇Next（下一步）。 |
| c. | 選擇Next（下一步）。
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| 6.4 | PreRun Check（運(yùn)行前檢查）
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在啟動(dòng)運(yùn)行之前，系統(tǒng)會(huì)檢查所有運(yùn)行組件、磁盤空間和網(wǎng)絡(luò)連接。
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| a. | 若有任何項(xiàng)目未通過運(yùn)行前檢查，則屏幕上將會(huì)顯示一條消息，說明如何更正錯(cuò)誤。有關(guān)詳細(xì)信息，參照MiSeq? 系統(tǒng)指南。 |
| b. | 當(dāng)所有項(xiàng)目均成功通過運(yùn)行前檢查時(shí)，請(qǐng)選擇Start Run（啟動(dòng)運(yùn)行）。 |
| 警告 MiSeq對(duì)振動(dòng)敏感。啟動(dòng)運(yùn)行后觸碰儀器會(huì)對(duì)測(cè)序結(jié)果造成不利影響。在選擇Start Run（啟動(dòng)運(yùn)行）后，請(qǐng)勿打開流動(dòng)槽倉門或試劑倉門或觸碰儀器監(jiān)控器，除非暫停運(yùn)行。 在開始運(yùn)行前，請(qǐng)確保關(guān)閉MiSeq上的所有文件，并且在運(yùn)行期間中請(qǐng)勿打開文件。 |
| 6.5 | 簇生成 |
| 模板生成是根據(jù)X和Y坐標(biāo)位置來定義簇在整個(gè)流動(dòng)槽表面上位置的過程。實(shí)時(shí)分析(RTA)使用運(yùn)行的前面幾個(gè)循環(huán)來生成模板。 |
| a. | 單個(gè)DNA文庫與引物雜交，然后通過聚合酶延伸結(jié)合的文庫。 |
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| b. | 變性雙鏈DNA，同時(shí)洗脫起始的DNA模板，新合成的鏈共價(jià)附著于流動(dòng)池表面。 |
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| c. | 單分子以隨機(jī)模式與流動(dòng)池結(jié)合 |
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| d. | 單鏈分子翻轉(zhuǎn)并通過與相鄰的互補(bǔ)引物雜交形成橋，雜交的引物通過聚合酶延伸。 |
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| e. | 橋式擴(kuò)增，雙鏈形成。 |
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| f. | 變性形成具有兩個(gè)共價(jià)結(jié)合的拷貝 |
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| g. | 單鏈分子翻轉(zhuǎn)以與相鄰引物雜交，雜交的引物通過聚合酶延伸。 |
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| h. | 多重橋式PCR擴(kuò)增。 |
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| i. | 變性，形成單鏈。 |
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