1. 脫頸處死小鼠，腹部朝上正體位暴露小鼠右側(cè)腹部。

2. 75％乙醇消毒，剪開腹部切取脾臟。

3. 將脾臟放入預(yù)先放置好cell strainer（FALCON，352350）并已加入5ml 無菌PBS的六孔板或培養(yǎng)皿中。

4. 用無菌注射器柄充分研磨脾臟。

5. 棄掉cell strainer，輕柔吹打細(xì)胞至充分重懸，收集到一無菌15 ml離心管中，于4℃ 400g，離心5 min。

注：一旦取出脾臟，請置于冰上操作。

6. 將第5步離心后棄上清的脾臟細(xì)胞用5 ml無菌ACK裂解液輕柔充分吹打混勻，于冰上裂解5 min。

注：ACK裂解液配方如下表，配好之后用0.22 μm的濾膜過濾，4℃保存不超過1月

7. 裂解結(jié)束后加入10 ml無菌PBS終止裂解反應(yīng)，于4℃ 400g離心5 min。

8. 棄上清，用10 ml無菌PBS洗一次，棄上清后直接加入培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，一只脾臟可得3-10′10⁷個(gè)細(xì)胞。

注：如果要進(jìn)行下一步的分離CD4+T細(xì)胞操作，請直接按照說明書將細(xì)胞重懸在合適體積的PBS中。