一.研究背景

腫瘤突變負荷（TMB）和拷貝數(shù)是預測病人免疫治療發(fā)應的預測標志物，之前的研究表明，有絲分裂和TMB、拷貝數(shù)以及發(fā)生在PMD區(qū)域的低甲基化水平相關，之前已經有很多研究探索了免疫治療反應和TMB以及拷貝數(shù)特征的關系，但很少有研究去探究甲基化水平的缺失和免疫治療反應的關系。

其中，部分甲基化結構域（PMD）是基因組的一個延伸區(qū)域，在該區(qū)域表現(xiàn)出了降低的平均DNA甲基化水平，PMD主要集中在那些編碼基因很少或者是轉錄失活的區(qū)域。LINE是長散在重復序列(long interspersed nuclear elements，LINE)，意為散在分布的長細胞核因子，是散在分布在哺乳動物基因中的一類重復序列，這種重復序列較長。

今天小編就和大家分享一篇關于探索病人整體甲基化水平的缺失在免疫治療方面影響的文章【Genetic alterations of m6A requlators predict poorer survival in acute myeloid leukemia.】。 雜志：Journal of Hematology & Oncology   IF：8.731   發(fā)表日期：2017.2.2

本文通過LINE-1探針中甲基化表達的平均值用來衡量一個病人的整體去甲基化表達水平。

在本篇研究中，Hyunchul Jung等人將關注的點集中到DNA甲基化水平缺失上，想去探索病人整體甲基化水平的缺失在免疫治療方面的影響。通過整合TCGA11種癌癥數(shù)據(jù)進行實驗分析，他們發(fā)現(xiàn)免疫調控通路相關的基因主要富集到的是PMD區(qū)域上，并且免疫調控通路相關的基因在那些CpG島啟動子超甲基化發(fā)生的去甲基化腫瘤中轉錄是被抑制的。進一步結合接受免疫治療的樣本數(shù)據(jù)，Hyunchul Jung等人還發(fā)現(xiàn)那些整體甲基化水平比較低的患者更容易從免疫治療中受益。

二.方法和材料

（1）數(shù)據(jù)：從PanCancer Atlas（https://gdc./aboutdata/publications/pancanatlas）中獲取TCGA數(shù)據(jù)庫中11種癌癥的癌癥的甲基化、mRNA表達和臨床數(shù)據(jù)；

（2）PMD甲基化水平數(shù)據(jù)：從Zhou等人[1]的研究中獲?。?a target="_blank">https://zwdzwd./pmd）。

（3）多倍體數(shù)據(jù)和腫瘤純度數(shù)據(jù)：從Taylor等人[2]的研究中收集得到多倍體數(shù)據(jù)和腫瘤純度數(shù)據(jù)。

（4）體細胞突變數(shù)據(jù)：從Davoli等人[3]的研究中獲取體細胞突變數(shù)據(jù)。

（5）整體甲基化水平：對于每一個樣本，得到LINE-1所有探針（具體參照GPL16304注釋信息）的表達β值，進一步計算這些探針甲基化表達值的平均值，該平均后的值就作為樣本的整體甲基化水平。

（6）高低甲基化組：基于整體甲基化水平的30%分位數(shù)和70分位數(shù)，將樣本劃分為低甲基化水平組（<30%分位數(shù)）和高甲基化水平組（>70%分位數(shù)）。

（7）細胞系數(shù)據(jù)：收集來自ENCODE數(shù)據(jù)庫中5個正常（HUVEC、IMR90、NHEK、BJ_1和BJ_2）以及來自UCSC和ENCODE的10個癌癥細胞系（MCF-7、SK-N-SH、HepG2、HeLa、A549、G401、LNCaP、T47D、H460和Caki-2）。

（8）功能富集分析：使用GSEA軟件對早期復制和后期復制的基因的功能進行富集分析。

（9）接受免疫治療的數(shù)據(jù)：整理來自SMC以及IDIBELL中抗PD-L1的肺癌數(shù)據(jù)和TCGA中接受了免疫治療的黑色素瘤數(shù)據(jù)。

（10）PMD亞型的識別：基于樣本的甲基化值和復制的時間點進行層次聚類，根據(jù)三類間不同長度的PMD分布，最終識別出了長PMD（L-PMD）、短PMD（S-PMD）以及中等程度的PMD（I-PMD）三類。

（11）生存分析：采用log-rank檢驗衡量兩組之間生存曲線的差異。

三.結果展示

1.  整體甲基化水平相關性分析：在TCGA泛癌分析中，如上述方法中描述的那樣得到整體甲基化水平，Hyunchul Jung等人進一步去刻畫整體甲基化水平和擴增（Fig 1a）、TMB（Fig 1b）、非整倍體（Fig 1c）以及CD8 T細胞表達水平（Fig 1d）之間的關系。

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Fig 1. 整體甲基化水平的相關性分析

2.  刻畫整體甲基化水平與免疫的關系：從Fig 1d中，發(fā)現(xiàn)整體甲基化水平與CD8 T細胞表達相關，進一步整合免疫相關通路，通過GSEA工具，是識別和整體甲基化水平、TMB以及非整倍性相關的通路（Fig 2），得到了與整體甲基化水平相關的免疫調控相關通路，如ANTIGEN_PROCESSING_AND_PRESENTATION、major histocompatibility complex (MHC)、cytokine–cytokine receptor interaction、interferon or other cytokine signaling和complement and coagulation等。

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Fig 2. 整體甲基化水平的相關性的免疫相關通路富集分析結果

3.  識別后復制基因的機制：因為甲基化水平的缺失主要發(fā)生在后復制區(qū)域，進一步探索這些后復制基因的轉錄抑制是否是由于整體甲基化水平的缺失所引起的?；诩毎禂?shù)據(jù)，通過比較正常和疾病細胞中的基因表達模式，識別早期復制基因和晚期復制基因，比較兩組基因之間基因表達、發(fā)生高甲基化cpg位點數(shù)、富集到的細胞周期相關通路數(shù)、富集到的免疫相關通路數(shù)以及相應的GSEA得分分布情況（Fig 3）。

Fig 3. 后復制基因參與功能的全面刻畫

4.  PMD中免疫基因的抑制：位于PMD中的基因的表達是受到抑制的，基于甲基化值和復制的時間點進行層次聚類，識別出了長PMD（L-PMD）、短PMD（S-PMD）以及中等程度的PMD（I-PMD）三類，進一步比較L-PMD、S-PMD以及I-PMD三類之間片段的長短，之前有研究報道，較短長度的PMD更能反應PMD特性，接下來，對S-PMD從富集到的功能，基因表達水平以及超甲基化cpg位點的分布情況進一步刻畫（Fig 4）。

Fig 4.PMD區(qū)域的進一步分類刻畫

5.  甲基化預測免疫反應：收集來自SMC以及IDIBELL中抗PD-L1的肺癌數(shù)據(jù)和TCGA中接受了免疫治療的黑色素瘤數(shù)據(jù)（Fig 5a），與依照TMB信息劃分樣本生存的情況比較，在Fig 5a中的數(shù)據(jù)集中去檢驗高低甲基化組病人之間的生存情況，發(fā)現(xiàn)基于甲基化水平的高低確實對于使用過免疫治療藥物的病人的生存有很好的預測（Fig 5），發(fā)現(xiàn)高甲基化水平組病人本身生存更好，對于那些低整體甲基化水平的病人來講，使用相應的免疫治療藥物對其生存會有很大的改善。

Fig 5. 甲基化水平預測樣本的免疫反應

6.  解析非整倍性：結合體細胞突變數(shù)據(jù)，Hyunchul Jung等人進一步去看整體甲基化水平高低能否解析與非整倍性之間的關系，發(fā)現(xiàn)整體的高低甲基化水平組體細胞突變（Fig 6）。

Fig 6. 整體甲基化水平與非整倍性的關系

四.結論

（1）甲基化水平的高低某種程度上反應了宿主對免疫治療是否有反應的一個更為有效的預測；

（2）對于那些存在整體甲基化水平缺失的病人來講，使用免疫治療藥物對于這一類病人的生存時間會有顯著地改善；

五.參考文獻

1.    Zhou, W. et al. DNA methylation loss in late-replicating domains is linked to mitotic cell division. Nat. Genet. 50, 591–602 (2018).

2.    Taylor, A. M. et al. Genomic and functional approaches to understanding cancer aneuploidy. Cancer Cell 33, 676–689 (2018). e3.

3.    Davoli, T., Uno, H., Wooten, E. C. & Elledge, S. J. Tumor aneuploidy correlates with markers of immune evasion and with reduced response to immunotherapy. Science 355, 8399 (2017).