WGCNA基本概念
加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析 (WGCNA, Weighted correlation network analysis)是用來描述不同樣品之間基因關(guān)聯(lián)模式的系統(tǒng)生物學方法，可以用來鑒定高度協(xié)同變化的基因集, 并根據(jù)基因集的內(nèi)連性和基因集與表型之間的關(guān)聯(lián)鑒定候補生物標記基因或治療靶點。 相比于只關(guān)注差異表達的基因，WGCNA利用數(shù)千或近萬個變化最大的基因或全部基因的信息識別感興趣的基因集，并與表型進行顯著性關(guān)聯(lián)分析。一是充分利用了信息，二是把數(shù)千個基因與表型的關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)換為數(shù)個基因集與表型的關(guān)聯(lián)，免去了多重假設(shè)檢驗校正的問題。 理解WGCNA，需要先理解下面幾個術(shù)語和它們在WGCNA中的定義。 共表達網(wǎng)絡(luò)：定義為加權(quán)基因網(wǎng)絡(luò)。點代表基因，邊代表基因表達相關(guān)性。加權(quán)是指對相關(guān)性值進行冥次運算(冥次的值也就是軟閾值 (power, pickSoftThreshold這個函數(shù)所做的就是確定合適的power))。無向網(wǎng)絡(luò)的邊屬性計算方式為abs(cor(genex, geney)) ^ power；有向網(wǎng)絡(luò)的邊屬性計算方式為(1+cor(genex, geney)/2) ^ power; sign hybrid的邊屬性計算方式為cor(genex, geney)^power if cor>0 else 0。這種處理方式強化了強相關(guān)，弱化了弱相關(guān)或負相關(guān)，使得相關(guān)性數(shù)值更符合無標度網(wǎng)絡(luò)特征，更具有生物意義。如果沒有合適的power，一般是由于部分樣品與其它樣品因為某種原因差別太大導致的，可根據(jù)具體問題移除部分樣品或查看后面的經(jīng)驗值。 Module(模塊)：高度內(nèi)連的基因集。在無向網(wǎng)絡(luò)中，模塊內(nèi)是高度相關(guān)的基因。在有向網(wǎng)絡(luò)中，模塊內(nèi)是高度正相關(guān)的基因。把基因聚類成模塊后，可以對每個模塊進行三個層次的分析：1. 功能富集分析查看其功能特征是否與研究目的相符；2. 模塊與性狀進行關(guān)聯(lián)分析，找出與關(guān)注性狀相關(guān)度最高的模塊；3. 模塊與樣本進行關(guān)聯(lián)分析，找到樣品特異高表達的模塊。 基因富集相關(guān)文章 去東方，最好用的在線GO富集分析工具；GO、GSEA富集分析一網(wǎng)打進；GSEA富集分析-界面操作。其它關(guān)聯(lián)后面都會提及。 Connectivity (連接度)：類似于網(wǎng)絡(luò)中 “度” (degree)的概念。每個基因的連接度是與其相連的基因的邊屬性之和。 Module eigengene E: 給定模型的第一主成分，代表整個模型的基因表達譜。這個是個很巧妙的梳理，我們之前講過PCA分析的降維作用，之前主要是拿來做可視化，現(xiàn)在用到這個地方，很好的用一個向量代替了一個矩陣，方便后期計算。(降維除了PCA，還可以看看tSNE) Intramodular connectivity: 給定基因與給定模型內(nèi)其他基因的關(guān)聯(lián)度，判斷基因所屬關(guān)系。 Module membership: 給定基因表達譜與給定模型的eigengene的相關(guān)性。 Hub gene: 關(guān)鍵基因 (連接度最多或連接多個模塊的基因)。 Adjacency matrix (鄰接矩陣)：基因和基因之間的加權(quán)相關(guān)性值構(gòu)成的矩陣。 TOM (Topological overlap matrix)：把鄰接矩陣轉(zhuǎn)換為拓撲重疊矩陣，以降低噪音和假相關(guān)，獲得的新距離矩陣，這個信息可拿來構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)或繪制TOM圖。
基本分析流程
構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡(luò)：使用加權(quán)的表達相關(guān)性。 識別基因集：基于加權(quán)相關(guān)性，進行層級聚類分析，并根據(jù)設(shè)定標準切分聚類結(jié)果，獲得不同的基因模塊，用聚類樹的分枝和不同顏色表示。 如果有表型信息，計算基因模塊與表型的相關(guān)性，鑒定性狀相關(guān)的模塊。 研究模型之間的關(guān)系，從系統(tǒng)層面查看不同模型的互作網(wǎng)絡(luò)。 從關(guān)鍵模型中選擇感興趣的驅(qū)動基因，或根據(jù)模型中已知基因的功能推測未知基因的功能。 導出TOM矩陣，繪制相關(guān)性圖。
WGCNA包實戰(zhàn)R包WGCNA是用于計算各種加權(quán)關(guān)聯(lián)分析的功能集合，可用于網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，基因篩選，基因簇鑒定，拓撲特征計算，數(shù)據(jù)模擬和可視化等。 輸入數(shù)據(jù)和參數(shù)選擇WGCNA本質(zhì)是基于相關(guān)系數(shù)的網(wǎng)絡(luò)分析方法，適用于多樣品數(shù)據(jù)模式，一般要求樣本數(shù)多于15個。樣本數(shù)多于20時效果更好，樣本越多，結(jié)果越穩(wěn)定。 基因表達矩陣: 常規(guī)表達矩陣即可，即基因在行，樣品在列，進入分析前做一個轉(zhuǎn)置。RPKM、FPKM或其它標準化方法影響不大，推薦使用Deseq2的varianceStabilizingTransformation或log2(x+1)對標準化后的數(shù)據(jù)做個轉(zhuǎn)換。如果數(shù)據(jù)來自不同的批次，需要先移除批次效應 (記得上次轉(zhuǎn)錄組培訓課講過如何操作)。如果數(shù)據(jù)存在系統(tǒng)偏移，需要做下quantile normalization。 性狀矩陣：用于關(guān)聯(lián)分析的性狀必須是數(shù)值型特征 (如下面示例中的Height, Weight,Diameter)。如果是區(qū)域或分類變量，需要轉(zhuǎn)換為0-1矩陣的形式(1表示屬于此組或有此屬性，0表示不屬于此組或無此屬性，如樣品分組信息WT, KO, OE)。 ID WT KO OE Height Weight Diameter
samp1 1 0 0 1 2 3
samp2 1 0 0 2 4 6
samp3 0 1 0 10 20 50
samp4 0 1 0 15 30 80
samp5 0 0 1 NA 9 8
samp6 0 0 1 4 8 7
推薦使用Signed network和Robust correlation (bicor)。(這個根據(jù)自己的需要，看看上面寫的每個網(wǎng)絡(luò)怎么計算的，更知道怎么選擇) 無向網(wǎng)絡(luò)在power小于15或有向網(wǎng)絡(luò)power小于30內(nèi)，沒有一個power值可以使無標度網(wǎng)絡(luò)圖譜結(jié)構(gòu)R^2達到0.8或平均連接度降到100以下，可能是由于部分樣品與其他樣品差別太大造成的。這可能由批次效應、樣品異質(zhì)性或實驗條件對表達影響太大等造成, 可以通過繪制樣品聚類查看分組信息、關(guān)聯(lián)批次信息、處理信息和有無異常樣品 (可以使用之前講過的熱圖簡化，增加行或列屬性)。如果這確實是由有意義的生物變化引起的，也可以使用后面程序中的經(jīng)驗power值。
安裝WGCNAWGCNA依賴的包比較多，bioconductor上的包需要自己安裝，cran上依賴的包可以自動安裝。通常在R中運行下面4條語句就可以完成WGCNA的安裝。 建議在編譯安裝R時增加--with-blas --with-lapack提高矩陣運算的速度，具體見R和Rstudio安裝。 #source('https:///biocLite.R')
#biocLite(c('AnnotationDbi', 'impute','GO.db', 'preprocessCore'))
#site='https://mirrors.tuna./CRAN'
#install.packages(c('WGCNA', 'stringr', 'reshape2'), repos=site)
WGCNA實戰(zhàn)實戰(zhàn)采用的是官方提供的清理后的矩陣，原矩陣信息太多，容易給人誤導，后臺回復WGCNA 獲取數(shù)據(jù)。 數(shù)據(jù)讀入library(WGCNA)
## Loading required package: dynamicTreeCut
## Loading required package: fastcluster
##
## Attaching package: 'fastcluster'
## The following object is masked from 'package:stats':
##
## hclust
## ==========================================================================
## *
## * Package WGCNA 1.63 loaded.
## *
## * Important note: It appears that your system supports multi-threading,
## * but it is not enabled within WGCNA in R.
## * To allow multi-threading within WGCNA with all available cores, use
## *
## * allowWGCNAThreads()
## *
## * within R. Use disableWGCNAThreads() to disable threading if necessary.
## * Alternatively, set the following environment variable on your system:
## *
## * ALLOW_WGCNA_THREADS=<number_of_processors>
## *
## * for example
## *
## * ALLOW_WGCNA_THREADS=48
## *
## * To set the environment variable in linux bash shell, type
## *
## * export ALLOW_WGCNA_THREADS=48
## *
## * before running R. Other operating systems or shells will
## * have a similar command to achieve the same aim.
## *
## ==========================================================================
##
## Attaching package: 'WGCNA'
## The following object is masked from 'package:stats':
##
## cor
library(reshape2)
library(stringr)
#
options(stringsAsFactors = FALSE)
# 打開多線程
enableWGCNAThreads()
## Allowing parallel execution with up to 47 working processes.
# 常規(guī)表達矩陣，log2轉(zhuǎn)換后或
# Deseq2的varianceStabilizingTransformation轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)
# 如果有批次效應，需要事先移除，可使用removeBatchEffect
# 如果有系統(tǒng)偏移(可用boxplot查看基因表達分布是否一致)，
# 需要quantile normalization
exprMat <- 'WGCNA/LiverFemaleClean.txt'
# 官方推薦 'signed' 或 'signed hybrid'
# 為與原文檔一致，故未修改
type = 'unsigned'
# 相關(guān)性計算
# 官方推薦 biweight mid-correlation & bicor
# corType: pearson or bicor
# 為與原文檔一致，故未修改
corType = 'pearson'
corFnc = ifelse(corType=='pearson', cor, bicor)
# 對二元變量，如樣本性狀信息計算相關(guān)性時，
# 或基因表達嚴重依賴于疾病狀態(tài)時，需設(shè)置下面參數(shù)
maxPOutliers = ifelse(corType=='pearson',1,0.05)
# 關(guān)聯(lián)樣品性狀的二元變量時，設(shè)置
robustY = ifelse(corType=='pearson',T,F)
##導入數(shù)據(jù)##
dataExpr <- read.table(exprMat, sep='\t', row.names=1, header=T,
quote='', comment='', check.names=F)
dim(dataExpr)
## [1] 3600 134
head(dataExpr)[,1:8]
## F2_2 F2_3 F2_14 F2_15 F2_19 F2_20
## MMT00000044 -0.01810 0.0642 6.44e-05 -0.05800 0.04830 -0.15197410
## MMT00000046 -0.07730 -0.0297 1.12e-01 -0.05890 0.04430 -0.09380000
## MMT00000051 -0.02260 0.0617 -1.29e-01 0.08710 -0.11500 -0.06502607
## MMT00000076 -0.00924 -0.1450 2.87e-02 -0.04390 0.00425 -0.23610000
## MMT00000080 -0.04870 0.0582 -4.83e-02 -0.03710 0.02510 0.08504274
## MMT00000102 0.17600 -0.1890 -6.50e-02 -0.00846 -0.00574 -0.01807182
## F2_23 F2_24
## MMT00000044 -0.00129 -0.23600
## MMT00000046 0.09340 0.02690
## MMT00000051 0.00249 -0.10200
## MMT00000076 -0.06900 0.01440
## MMT00000080 0.04450 0.00167
## MMT00000102 -0.12500 -0.06820
數(shù)據(jù)篩選 ## 篩選中位絕對偏差前75%的基因，至少MAD大于0.01
## 篩選后會降低運算量，也會失去部分信息
## 也可不做篩選，使MAD大于0即可
m.mad <- apply(dataExpr,1,mad)
dataExprVar <- dataExpr[which(m.mad >
max(quantile(m.mad, probs=seq(0, 1, 0.25))[2],0.01)),]
## 轉(zhuǎn)換為樣品在行，基因在列的矩陣
dataExpr <- as.data.frame(t(dataExprVar))
## 檢測缺失值
gsg = goodSamplesGenes(dataExpr, verbose = 3)
## Flagging genes and samples with too many missing values...
## ..step 1
if (!gsg$allOK){
# Optionally, print the gene and sample names that were removed:
if (sum(!gsg$goodGenes)>0)
printFlush(paste('Removing genes:',
paste(names(dataExpr)[!gsg$goodGenes], collapse = ',')));
if (sum(!gsg$goodSamples)>0)
printFlush(paste('Removing samples:',
paste(rownames(dataExpr)[!gsg$goodSamples], collapse = ',')));
# Remove the offending genes and samples from the data:
dataExpr = dataExpr[gsg$goodSamples, gsg$goodGenes]
}
nGenes = ncol(dataExpr)
nSamples = nrow(dataExpr)
dim(dataExpr)
## [1] 134 2697
head(dataExpr)[,1:8]
## MMT00000051 MMT00000080 MMT00000102 MMT00000149 MMT00000159
## F2_2 -0.02260000 -0.04870000 0.17600000 0.07680000 -0.14800000
## F2_3 0.06170000 0.05820000 -0.18900000 0.18600000 0.17700000
## F2_14 -0.12900000 -0.04830000 -0.06500000 0.21400000 -0.13200000
## F2_15 0.08710000 -0.03710000 -0.00846000 0.12000000 0.10700000
## F2_19 -0.11500000 0.02510000 -0.00574000 0.02100000 -0.11900000
## F2_20 -0.06502607 0.08504274 -0.01807182 0.06222751 -0.05497686
## MMT00000207 MMT00000212 MMT00000241
## F2_2 0.06870000 0.06090000 -0.01770000
## F2_3 0.10100000 0.05570000 -0.03690000
## F2_14 0.10900000 0.19100000 -0.15700000
## F2_15 -0.00858000 -0.12100000 0.06290000
## F2_19 0.10500000 0.05410000 -0.17300000
## F2_20 -0.02441415 0.06343181 0.06627665
軟閾值篩選## 查看是否有離群樣品
sampleTree = hclust(dist(dataExpr), method = 'average')
plot(sampleTree, main = 'Sample clustering to detect outliers', sub='', xlab='')
軟閾值的篩選原則是使構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)更符合無標度網(wǎng)絡(luò)特征。 powers = c(c(1:10), seq(from = 12, to=30, by=2))
sft = pickSoftThreshold(dataExpr, powerVector=powers,
networkType=type, verbose=5)
## pickSoftThreshold: will use block size 2697.
## pickSoftThreshold: calculating connectivity for given powers...
## ..working on genes 1 through 2697 of 2697
## Power SFT.R.sq slope truncated.R.sq mean.k. median.k. max.k.
## 1 1 0.1370 0.825 0.412 587.000 5.95e+02 922.0
## 2 2 0.0416 -0.332 0.630 206.000 2.02e+02 443.0
## 3 3 0.2280 -0.747 0.920 91.500 8.43e+01 247.0
## 4 4 0.3910 -1.120 0.908 47.400 4.02e+01 154.0
## 5 5 0.7320 -1.230 0.958 27.400 2.14e+01 102.0
## 6 6 0.8810 -1.490 0.916 17.200 1.22e+01 83.7
## 7 7 0.8940 -1.640 0.869 11.600 7.29e+00 75.4
## 8 8 0.8620 -1.660 0.827 8.250 4.56e+00 69.2
## 9 9 0.8200 -1.600 0.810 6.160 2.97e+00 64.2
## 10 10 0.8390 -1.560 0.855 4.780 2.01e+00 60.1
## 11 12 0.8020 -1.410 0.866 3.160 9.61e-01 53.2
## 12 14 0.8470 -1.340 0.909 2.280 4.84e-01 47.7
## 13 16 0.8850 -1.250 0.932 1.750 2.64e-01 43.1
## 14 18 0.8830 -1.210 0.922 1.400 1.46e-01 39.1
## 15 20 0.9110 -1.180 0.926 1.150 8.35e-02 35.6
## 16 22 0.9160 -1.140 0.927 0.968 5.02e-02 32.6
## 17 24 0.9520 -1.120 0.961 0.828 2.89e-02 29.9
## 18 26 0.9520 -1.120 0.944 0.716 1.77e-02 27.5
## 19 28 0.9380 -1.120 0.922 0.626 1.08e-02 25.4
## 20 30 0.9620 -1.110 0.951 0.551 6.49e-03 23.5
par(mfrow = c(1,2))
cex1 = 0.9
# 橫軸是Soft threshold (power)，縱軸是無標度網(wǎng)絡(luò)的評估參數(shù)，數(shù)值越高，
# 網(wǎng)絡(luò)越符合無標度特征 (non-scale)
plot(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
xlab='Soft Threshold (power)',
ylab='Scale Free Topology Model Fit,signed R^2',type='n',
main = paste('Scale independence'))
text(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
labels=powers,cex=cex1,col='red')
# 篩選標準。R-square=0.85
abline(h=0.85,col='red')
# Soft threshold與平均連通性
plot(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5],
xlab='Soft Threshold (power)',ylab='Mean Connectivity', type='n',
main = paste('Mean connectivity'))
text(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], labels=powers,
cex=cex1, col='red')
power = sft$powerEstimate
power
## [1] 6
經(jīng)驗power (無滿足條件的power時選用)# 無向網(wǎng)絡(luò)在power小于15或有向網(wǎng)絡(luò)power小于30內(nèi)，沒有一個power值可以使
# 無標度網(wǎng)絡(luò)圖譜結(jié)構(gòu)R^2達到0.8，平均連接度較高如在100以上，可能是由于
# 部分樣品與其他樣品差別太大。這可能由批次效應、樣品異質(zhì)性或?qū)嶒灄l件對
# 表達影響太大等造成?？梢酝ㄟ^繪制樣品聚類查看分組信息和有無異常樣品。
# 如果這確實是由有意義的生物變化引起的，也可以使用下面的經(jīng)驗power值。
if (is.na(power)){
power = ifelse(nSamples<20, ifelse(type == 'unsigned', 9, 18),
ifelse(nSamples<30, ifelse(type == 'unsigned', 8, 16),
ifelse(nSamples<40, ifelse(type == 'unsigned', 7, 14),
ifelse(type == 'unsigned', 6, 12))
)
)
}
網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建##一步法網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：One-step network construction and module detection##
# power: 上一步計算的軟閾值
# maxBlockSize: 計算機能處理的最大模塊的基因數(shù)量 (默認5000)；
# 4G內(nèi)存電腦可處理8000-10000個，16G內(nèi)存電腦可以處理2萬個，32G內(nèi)存電腦可
# 以處理3萬個
# 計算資源允許的情況下最好放在一個block里面。
# corType: pearson or bicor
# numericLabels: 返回數(shù)字而不是顏色作為模塊的名字，后面可以再轉(zhuǎn)換為顏色
# saveTOMs：最耗費時間的計算，存儲起來，供后續(xù)使用
# mergeCutHeight: 合并模塊的閾值，越大模塊越少
net = blockwiseModules(dataExpr, power = power, maxBlockSize = nGenes,
TOMType = type, minModuleSize = 30,
reassignThreshold = 0, mergeCutHeight = 0.25,
numericLabels = TRUE, pamRespectsDendro = FALSE,
saveTOMs=TRUE, corType = corType,
maxPOutliers=maxPOutliers, loadTOMs=TRUE,
saveTOMFileBase = paste0(exprMat, '.tom'),
verbose = 3)
## Calculating module eigengenes block-wise from all genes
## Flagging genes and samples with too many missing values...
## ..step 1
## ..Working on block 1 .
## TOM calculation: adjacency..
## ..will use 47 parallel threads.
## Fraction of slow calculations: 0.000000
## ..connectivity..
## ..matrix multiplication (system BLAS)..
## ..normalization..
## ..done.
## ..saving TOM for block 1 into file WGCNA/LiverFemaleClean.txt.tom-block.1.RData
## ....clustering..
## ....detecting modules..
## ....calculating module eigengenes..
## ....checking kME in modules..
## ..removing 3 genes from module 1 because their KME is too low.
## ..removing 5 genes from module 12 because their KME is too low.
## ..removing 1 genes from module 14 because their KME is too low.
## ..merging modules that are too close..
## mergeCloseModules: Merging modules whose distance is less than 0.25
## Calculating new MEs...
# 根據(jù)模塊中基因數(shù)目的多少，降序排列，依次編號為 `1-最大模塊數(shù)`。
# **0 (grey)**表示**未**分入任何模塊的基因。
table(net$colors)
##
## 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
## 135 472 356 333 307 303 177 158 102 94 69 66 63 62
層級聚類樹展示各個模塊## 灰色的為**未分類**到模塊的基因。
# Convert labels to colors for plotting
moduleLabels = net$colors
moduleColors = labels2colors(moduleLabels)
# Plot the dendrogram and the module colors underneath
# 如果對結(jié)果不滿意，還可以recutBlockwiseTrees，節(jié)省計算時間
plotDendroAndColors(net$dendrograms[[1]], moduleColors[net$blockGenes[[1]]],
'Module colors',
dendroLabels = FALSE, hang = 0.03,
addGuide = TRUE, guideHang = 0.05)
繪制模塊之間相關(guān)性圖# module eigengene, 可以繪制線圖，作為每個模塊的基因表達趨勢的展示
MEs = net$MEs
### 不需要重新計算，改下列名字就好
### 官方教程是重新計算的，起始可以不用這么麻煩
MEs_col = MEs
colnames(MEs_col) = paste0('ME', labels2colors(
as.numeric(str_replace_all(colnames(MEs),'ME',''))))
MEs_col = orderMEs(MEs_col)
# 根據(jù)基因間表達量進行聚類所得到的各模塊間的相關(guān)性圖
# marDendro/marHeatmap 設(shè)置下、左、上、右的邊距
plotEigengeneNetworks(MEs_col, 'Eigengene adjacency heatmap',
marDendro = c(3,3,2,4),
marHeatmap = c(3,4,2,2), plotDendrograms = T,
xLabelsAngle = 90)
## 如果有表型數(shù)據(jù)，也可以跟ME數(shù)據(jù)放一起，一起出圖
#MEs_colpheno = orderMEs(cbind(MEs_col, traitData))
#plotEigengeneNetworks(MEs_colpheno, 'Eigengene adjacency heatmap',
# marDendro = c(3,3,2,4),
# marHeatmap = c(3,4,2,2), plotDendrograms = T,
# xLabelsAngle = 90)
可視化基因網(wǎng)絡(luò) (TOM plot)# 如果采用分步計算，或設(shè)置的blocksize>=總基因數(shù)，直接load計算好的TOM結(jié)果
# 否則需要再計算一遍，比較耗費時間
# TOM = TOMsimilarityFromExpr(dataExpr, power=power, corType=corType, networkType=type)
load(net$TOMFiles[1], verbose=T)
## Loading objects:
## TOM
TOM <- as.matrix(TOM)
dissTOM = 1-TOM
# Transform dissTOM with a power to make moderately strong
# connections more visible in the heatmap
plotTOM = dissTOM^7
# Set diagonal to NA for a nicer plot
diag(plotTOM) = NA
# Call the plot function
# 這一部分特別耗時，行列同時做層級聚類
TOMplot(plotTOM, net$dendrograms, moduleColors,
main = 'Network heatmap plot, all genes')
導出網(wǎng)絡(luò)用于CytoscapeCytoscape繪制網(wǎng)絡(luò)圖見我們更新版的視頻教程或https://bioinfo.ke.qq.com/。 probes = colnames(dataExpr)
dimnames(TOM) <- list(probes, probes)
# Export the network into edge and node list files Cytoscape can read
# threshold 默認為0.5, 可以根據(jù)自己的需要調(diào)整，也可以都導出后在
# cytoscape中再調(diào)整
cyt = exportNetworkToCytoscape(TOM,
edgeFile = paste(exprMat, '.edges.txt', sep=''),
nodeFile = paste(exprMat, '.nodes.txt', sep=''),
weighted = TRUE, threshold = 0,
nodeNames = probes, nodeAttr = moduleColors)
關(guān)聯(lián)表型數(shù)據(jù)trait <- 'WGCNA/TraitsClean.txt'
# 讀入表型數(shù)據(jù)，不是必須的
if(trait != '') {
traitData <- read.table(file=trait, sep='\t', header=T, row.names=1,
check.names=FALSE, comment='',quote='')
sampleName = rownames(dataExpr)
traitData = traitData[match(sampleName, rownames(traitData)), ]
}
### 模塊與表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)
if (corType=='pearsoon') {
modTraitCor = cor(MEs_col, traitData, use = 'p')
modTraitP = corPvalueStudent(modTraitCor, nSamples)
} else {
modTraitCorP = bicorAndPvalue(MEs_col, traitData, robustY=robustY)
modTraitCor = modTraitCorP$bicor
modTraitP = modTraitCorP$p
}
## Warning in bicor(x, y, use = use, ...): bicor: zero MAD in variable 'y'.
## Pearson correlation was used for individual columns with zero (or missing)
## MAD.
# signif表示保留幾位小數(shù)
textMatrix = paste(signif(modTraitCor, 2), '\n(', signif(modTraitP, 1), ')', sep = '')
dim(textMatrix) = dim(modTraitCor)
labeledHeatmap(Matrix = modTraitCor, xLabels = colnames(traitData),
yLabels = colnames(MEs_col),
cex.lab = 0.5,
ySymbols = colnames(MEs_col), colorLabels = FALSE,
colors = blueWhiteRed(50),
textMatrix = textMatrix, setStdMargins = FALSE,
cex.text = 0.5, zlim = c(-1,1),
main = paste('Module-trait relationships'))
模塊內(nèi)基因與表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián), 從上圖可以看到MEmagenta與Insulin_ug_l相關(guān)，選取這兩部分進行分析。 ## 從上圖可以看到MEmagenta與Insulin_ug_l相關(guān)
## 模塊內(nèi)基因與表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)
# 性狀跟模塊雖然求出了相關(guān)性，可以挑選最相關(guān)的那些模塊來分析，
# 但是模塊本身仍然包含非常多的基因，還需進一步的尋找最重要的基因。
# 所有的模塊都可以跟基因算出相關(guān)系數(shù)，所有的連續(xù)型性狀也可以跟基因的表達
# 值算出相關(guān)系數(shù)。
# 如果跟性狀顯著相關(guān)基因也跟某個模塊顯著相關(guān)，那么這些基因可能就非常重要
# 。
### 計算模塊與基因的相關(guān)性矩陣
if (corType=='pearsoon') {
geneModuleMembership = as.data.frame(cor(dataExpr, MEs_col, use = 'p'))
MMPvalue = as.data.frame(corPvalueStudent(
as.matrix(geneModuleMembership), nSamples))
} else {
geneModuleMembershipA = bicorAndPvalue(dataExpr, MEs_col, robustY=robustY)
geneModuleMembership = geneModuleMembershipA$bicor
MMPvalue = geneModuleMembershipA$p
}
# 計算性狀與基因的相關(guān)性矩陣
## 只有連續(xù)型性狀才能進行計算，如果是離散變量，在構(gòu)建樣品表時就轉(zhuǎn)為0-1矩陣。
if (corType=='pearsoon') {
geneTraitCor = as.data.frame(cor(dataExpr, traitData, use = 'p'))
geneTraitP = as.data.frame(corPvalueStudent(
as.matrix(geneTraitCor), nSamples))
} else {
geneTraitCorA = bicorAndPvalue(dataExpr, traitData, robustY=robustY)
geneTraitCor = as.data.frame(geneTraitCorA$bicor)
geneTraitP = as.data.frame(geneTraitCorA$p)
}
## Warning in bicor(x, y, use = use, ...): bicor: zero MAD in variable 'y'.
## Pearson correlation was used for individual columns with zero (or missing)
## MAD.
# 最后把兩個相關(guān)性矩陣聯(lián)合起來,指定感興趣模塊進行分析
module = 'magenta'
pheno = 'Insulin_ug_l'
modNames = substring(colnames(MEs_col), 3)
# 獲取關(guān)注的列
module_column = match(module, modNames)
pheno_column = match(pheno,colnames(traitData))
# 獲取模塊內(nèi)的基因
moduleGenes = moduleColors == module
sizeGrWindow(7, 7)
par(mfrow = c(1,1))
# 與性狀高度相關(guān)的基因，也是與性狀相關(guān)的模型的關(guān)鍵基因
verboseScatterplot(abs(geneModuleMembership[moduleGenes, module_column]),
abs(geneTraitCor[moduleGenes, pheno_column]),
xlab = paste('Module Membership in', module, 'module'),
ylab = paste('Gene significance for', pheno),
main = paste('Module membership vs. gene significance\n'),
cex.main = 1.2, cex.lab = 1.2, cex.axis = 1.2, col = module)
分步法展示每一步都做了什么### 計算鄰接矩陣
adjacency = adjacency(dataExpr, power = power)
### 把鄰接矩陣轉(zhuǎn)換為拓撲重疊矩陣，以降低噪音和假相關(guān)，獲得距離矩陣。
TOM = TOMsimilarity(adjacency)
dissTOM = 1-TOM
### 層級聚類計算基因之間的距離樹
geneTree = hclust(as.dist(dissTOM), method = 'average')
### 模塊合并
# We like large modules, so we set the minimum module size relatively high:
minModuleSize = 30
# Module identification using dynamic tree cut:
dynamicMods = cutreeDynamic(dendro = geneTree, distM = dissTOM,
deepSplit = 2, pamRespectsDendro = FALSE,
minClusterSize = minModuleSize)
# Convert numeric lables into colors
dynamicColors = labels2colors(dynamicMods)
### 通過計算模塊的代表性模式和模塊之間的定量相似性評估，合并表達圖譜相似
的模塊
MEList = moduleEigengenes(datExpr, colors = dynamicColors)
MEs = MEList$eigengenes
# Calculate dissimilarity of module eigengenes
MEDiss = 1-cor(MEs)
# Cluster module eigengenes
METree = hclust(as.dist(MEDiss), method = 'average')
MEDissThres = 0.25
# Call an automatic merging function
merge = mergeCloseModules(datExpr, dynamicColors, cutHeight = MEDissThres, verbose = 3)
# The merged module colors
mergedColors = merge$colors;
# Eigengenes of the new merged
## 分步法完結(jié)
Reference:
官網(wǎng)：https://horvath.genetics./html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/Tutorials/ 術(shù)語解釋：https://horvath.genetics./html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/Tutorials/Simulated-00-Background.pdf FAQ：https://horvath.genetics./html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/faq.html 生信博客：http://blog. 高顏值免費在線繪圖工具升級版來了~~~ （可以在線做 WGCNA 分析）
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