點(diǎn)擊藍(lán)字↑↑↑“轉(zhuǎn)錄組”，輕松關(guān)注不迷z

 RT-PCR是Reverse Transcription PCR的簡(jiǎn)稱，中文名為逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，這是一種將RNA經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，再將cDNA作為模板，擴(kuò)增合成目的片段的分子生物學(xué)技術(shù)。這種技術(shù)靈敏用途廣泛，不僅可以快速檢測(cè)基因表達(dá)差異，還可以不必構(gòu)建cDNA文庫(kù)，克隆cDNA，而且RT-PCR作為模板的RNA種類不是那么嚴(yán)格，可以是總RNA，或者是mRNA，也可以是體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物，是一項(xiàng)處理RNA常用到的經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)。

 RT-PCR總的技術(shù)路線是：RNA提取——引物設(shè)計(jì)——RT-PCR-——電泳，這四個(gè)部分構(gòu)成了我們的整個(gè)RT-PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)難度不是很高，但是注意事項(xiàng)很多，一不小心，就會(huì)失敗，這樣既浪費(fèi)RNA和試劑耗材，也浪費(fèi)了時(shí)間，那么怎么才能做好RT-PCR呢？下面“好戲登場(chǎng)”了，請(qǐng)小伙伴們拿起筆和筆記本，我們一起學(xué)習(xí)一遍這項(xiàng)讓人“又愛(ài)又恨”的PCR技術(shù)吧。

一、 RNA提取

在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，RNA是當(dāng)之無(wú)愧的主角，是作為模板的存在，要想確保RT-PCR成功，關(guān)鍵一點(diǎn)是確保模板RNA無(wú)RNA酶和基因組DNA的污染，因此提取出高質(zhì)量的RNA是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素，那么如何才能提取出高質(zhì)量的RNA呢，重要的一點(diǎn)就是盡力杜絕RNA的內(nèi)外源性污染，具體方法可以回顧本號(hào)前幾天的文章《如何提取出高質(zhì)量的RNA，一文帶你“掃雷”》，鏈接地址：https://mp.weixin.qq.com/s/zouXWqGnoyHWdGu7pAEkpQ，學(xué)習(xí)更加詳細(xì)的方法。

二、 引物設(shè)計(jì)

用于反轉(zhuǎn)錄的引物，可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT、特異性引物中的一種，此外對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種引物都可以。在設(shè)計(jì)特異性引物的時(shí)候我們根據(jù)目的基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，交由公司合成，在設(shè)計(jì)引物過(guò)程中，我們還需要遵循引物設(shè)計(jì)原則:

1、 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在75-200bp

2、 引物長(zhǎng)度在15-25堿基之間

3、 G+C含量在50%-60%之間，上下游引物T_m 值不能超過(guò)2℃的差異

4、 避免3個(gè)G或者C堿基的重復(fù)

5、 避免二級(jí)結(jié)構(gòu)形成引物之間避免出現(xiàn)3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)，避免出現(xiàn)引物二聚體

6、 避開(kāi)內(nèi)含子，以免基因組DNA污染

7、 最后用BLAST驗(yàn)證引物特異性

三、 RT-PCR

該實(shí)驗(yàn)有兩種方法進(jìn)行：一步法和兩步法，在一步法中，RT-PCR中逆轉(zhuǎn)錄和PCR在為它們優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行；兩步法中RT-PCR下中每一步都在最佳條件下進(jìn)行cDNA的合成，首先在逆轉(zhuǎn)循環(huán)緩沖液中進(jìn)行，取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。

 首先介紹的是一步法，一步法的優(yōu)點(diǎn)是在cDNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開(kāi)管蓋和吸取轉(zhuǎn)移樣品，方便處理大量樣品，有助于減少殘余污染。

設(shè)備及材料:PCR儀、電泳儀、RNA、一步法試劑盒（天根、TAKALA等等）、無(wú)RNase槍頭、移液器、鑷子、冰浴箱、超凈臺(tái)、EP管

步驟：

1、 將RNA、引物、試劑盒試劑短暫離心混勻后放在冰浴上保持低溫，否則會(huì)發(fā)生降解失效。

2、 體系配置和PCR條件設(shè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)添加即可跑程序。

其次介紹的是兩步法，兩步法優(yōu)點(diǎn)是反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增分兩步進(jìn)行，首先從 RNA 模板反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，得到的 cDNA 再進(jìn)行一次或多次不同的 PCR 反應(yīng)，可以從一個(gè)特定的樣品中反轉(zhuǎn)錄出所有的 mRNA 的信息，減少人為誤差，在聚合酶和引物的選擇上更加靈活。

設(shè)備及材料:PCR儀、電泳儀、RNA、兩步法試劑盒（天根、TAKALA等等）、無(wú)RNase槍頭、移液器、鑷子、冰浴箱、超凈臺(tái)、EP管

步驟：

1、 第一步：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

2、 第二步：PCR反應(yīng)

兩個(gè)步驟都按照兩步法試劑盒說(shuō)明書(shū)添加體系即可跑PCR程序。

注意事項(xiàng)：

1、 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備好無(wú)RNase的槍頭和EP管等，實(shí)驗(yàn)前用滅菌過(guò)的鑷子將槍頭和EP管插好，等待使用，如果是普通槍頭和EP管需要用0.1%的DEPC水浸泡一晚，然后高溫濕熱滅菌，取出來(lái)后烘干水分等待使用。

2、 反應(yīng)體系計(jì)算：反應(yīng)體系應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量多配置兩管，避免液體沾到槍頭上導(dǎo)致樣品含量不夠，

3、 實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)該全程佩戴口罩和手套，減少人員流動(dòng)。

4、 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的加樣應(yīng)該在超凈臺(tái)中進(jìn)行減少污染風(fēng)險(xiǎn)。

5、 加樣過(guò)程中，要注意不同試劑需要更換槍頭

6、 所有試劑都應(yīng)該在冰浴上融化，等待完全融化后在吸取試劑。

7、 設(shè)置陽(yáng)陰性對(duì)照

四、 電泳

材料：瓊脂糖、EB、1xTAE溶液、loading buff、2000Marker、PCR產(chǎn)物

1、配膠:

8孔小膠  TAE 20ml、瓊脂糖 0.30g

25孔中膠 TAE 40ml、瓊脂糖 0.6g

操作步驟：

1、將電泳槽清洗干凈并晾干，插好梳子。

1、稱取瓊脂糖放入配膠專用燒瓶倒入相應(yīng)的1×TAE含量。

2、將燒瓶加熱煮沸。

3、將沸騰的液體中加入EB一般小膠2ul，中膠6ul。

4、倒入電泳槽，倒入時(shí)緩慢倒入防止產(chǎn)生氣泡，待30分鐘左右瓊脂糖凝膠凝固后拔出梳子進(jìn)行跑膠。

2、跑膠:

（1）電泳槽加入1×TAE,電泳緩沖液，將瓊脂糖凝膠放入電泳槽，緩沖液沒(méi)過(guò)膠。 

（2）將5ul PCR產(chǎn)物和1ul 6x loading buff混勻加入膠板單格，加入3ul Marker

（3）接通電源，100v跑膠。(跑膠方向是從負(fù)極到正極）,當(dāng)條帶跑到2/3時(shí)停止跑膠，帶手套取膠放在紫外凝膠成像儀觀察。

3、條帶觀察：

觀察原則：

1、 是否有擴(kuò)增產(chǎn)物，如上圖出現(xiàn)了明顯的條帶，表明有擴(kuò)增產(chǎn)物。

2、 觀察是否有拖尾或者區(qū)帶，如有則說(shuō)明有非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，如上圖只有單一條帶，則表明擴(kuò)增成功。

3、 分子量標(biāo)準(zhǔn)區(qū)帶是否分開(kāi)，如上圖Marker區(qū)帶分開(kāi)明顯。

4、 與分子量標(biāo)準(zhǔn)比較，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度是否正確，如上圖產(chǎn)物長(zhǎng)度在400bp左右，產(chǎn)物長(zhǎng)度需要與自己先前的目的基因長(zhǎng)度相互印證。

5、 是否出現(xiàn)引物二聚體，如有條帶模糊不整齊一致，條帶寬等現(xiàn)象，可能是引物二聚體，如上圖條帶單一整齊一致 則表明沒(méi)有引物二聚體。

6、 如果出現(xiàn)引物二聚體，解決方法是（1）重新設(shè)計(jì)引物，這是最根本的方法（2）cDNA出現(xiàn)污染問(wèn)題，通常出現(xiàn)在兩步法中（3）模板濃度小，適當(dāng)增加模板濃度（4）適當(dāng)提高退火溫度，摸索退火條件。

RT-PCR技術(shù)應(yīng)用廣泛，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該多注意總結(jié)出現(xiàn)的問(wèn)題，爭(zhēng)取不出現(xiàn)差錯(cuò)，那么就會(huì)順利的做成RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

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