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原名：Unveiling ncRNA regulatory axes in atherosclerosis progression

譯名：非編碼RNA(ncRNA)調(diào)控軸在動脈粥樣硬化進(jìn)展中的作用

期刊：Clinical and Translational Medicine

IF：7.919

發(fā)表時(shí)間：2020年2月

通訊作者：Estanislao Navarro

通訊作者單位：西班牙Bellvitge生物醫(yī)學(xué)研究所，腎病醫(yī)院

DOI號：10.1186/s40169-020-0256-3

動脈粥樣硬化（ATH）是一種復(fù)雜的血管壁炎性疾病，基因組學(xué)，表觀遺傳修飾和環(huán)境條件等多種因素參與其中，給老齡人口帶來了沉重負(fù)擔(dān)。其病因和機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，主要依賴生活方式的改善。因此，迫切需要開發(fā)一種更加個(gè)性化的藥物，通過有效的干預(yù)措施來提高患者的診療水平。基于這個(gè)層面，ATH基因組學(xué)的研究為生物醫(yī)學(xué)界提供了與基因相關(guān)的ATH危險(xiǎn)因素，如SNP，基因和基因變異，DNA甲基化改變，基因表達(dá)變化等。近幾年，一個(gè)新的因素：高度異質(zhì)的非編碼RNA組，正逐漸成為動脈粥樣硬化（和其他疾?。┭芯康闹匾蛩兀瑹o論是疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物還是病理生理學(xué)中間產(chǎn)物，它們的相互作用都突出了人類基因組結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性。

從無到有，非編碼RNA是轉(zhuǎn)錄組的功能性組成部分。人類基因組測序分析發(fā)現(xiàn)超過80％的基因組具有生化活性，大多數(shù)是以DNA聚合酶I可及位點(diǎn)或候選調(diào)控序列的形式出現(xiàn)。而最近估計(jì)人類基因組中蛋白質(zhì)編碼基因的數(shù)量為20–25000，但活躍基因組位點(diǎn)的總數(shù)接近10^5,其中就存在大量非蛋白質(zhì)非均質(zhì)RNA，這種RNA最初被認(rèn)為是“the dark轉(zhuǎn)錄組”或“基因組dark物質(zhì)”的一部分，即功能不確定或未知的基因組序列。非編碼RNA最初按其長度分為短（<200個(gè)核苷酸長）和長（lncRNA> 200個(gè)核苷酸長）RNA。短ncRNA包括已知的snRNA，snoRNA和tRNA，與PIWI相關(guān)的RNA（它們抑制種系中轉(zhuǎn)座子和重復(fù)元件的表達(dá)以維持基因組穩(wěn)定性）以及調(diào)控翻譯的microRNA（miRNA）家族。另一方面，lncRNAs在大小和功能上是屬于高度異質(zhì)的群體，其在發(fā)育、分化和疾病進(jìn)展中具有調(diào)節(jié)作用，并且其表達(dá)經(jīng)常發(fā)生變化。

非編碼RNA表達(dá)的數(shù)據(jù)是人類基因組功能的新模型，除了核轉(zhuǎn)錄外甚至在內(nèi)含子和基因間位點(diǎn)都普遍實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生了復(fù)雜的具有假定調(diào)節(jié)功能的長或短非編碼RNA群體。在哺乳動物基因組中，有一個(gè)數(shù)量級以上的基因組序列轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA而不是編碼RNA。這使得遺傳信息流由原始的線性“ DNA產(chǎn)生RNA產(chǎn)生蛋白質(zhì)”轉(zhuǎn)變?yōu)橛稍S多結(jié)構(gòu)性或調(diào)節(jié)性RNA建立起來的不同層次的相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖1）。這種改變也使得與疾病相關(guān)的非編碼RNA的數(shù)量呈指數(shù)增長、使得表觀遺傳控制更加具有可塑性。本綜述中，作者將對ATH進(jìn)程中ncRNA、microRNA、mRNA的相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行一一闡述。此外，還將包括其他少見報(bào)道的轉(zhuǎn)錄本，如假基因和Alu元素與miRNA之間的相互作用的揭示。

圖1.遺傳信息流的變化。方框內(nèi)是線性遺傳信息流紅色：RNA之間的功能關(guān)系。黑色箭頭：轉(zhuǎn)錄或翻譯；雙頭紅色箭頭：相互交互；紅色單向箭頭：功能交互；虛線：組蛋白編碼和染色質(zhì)

修飾

2    DNA測序以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)與個(gè)體化藥物的整合

隨著DNA測序技術(shù)的飛速成熟，醫(yī)學(xué)研究從人類基因組測序發(fā)展至個(gè)體化基因組測序。如今，在整個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，整個(gè)基因組或外顯子組的DNA測序已然成為一種疾病的診療工具。此外，單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）方法可實(shí)現(xiàn)對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行全基因組分析，以鑒定基因突變并表征和量化細(xì)胞異質(zhì)性及其在疾病中的變異。

序列存儲，是測序革命成功的關(guān)鍵因素之一。三個(gè)鏡像序列存儲庫（NCBI的GenBank，日本DNA數(shù)據(jù)庫和歐洲核苷酸檔案庫表1）與國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫合作，注釋并提供了對所有DNA和RNA序列公開且不受限制的訪問權(quán)限。這些存儲庫不僅賦予DNA/RNA序列唯一的序列標(biāo)識符，還創(chuàng)建了“參考基因組”數(shù)據(jù)庫，包含參考基因組，轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)序列的集合，旨在用作基因組研究中的主要序列參考。此外，數(shù)據(jù)庫還為序列提供了各種注釋，從功能域到基因組位點(diǎn)。最后，所有這些信息都已集成到“基因組瀏覽器”中（Ensembl和NCBI的基因組查看器），允許用戶查看從染色體區(qū)域到任何轉(zhuǎn)錄單位及其可變體的序列。

測序技術(shù)的革命。DNA測序技術(shù)經(jīng)歷了超薄PAGE凝膠、熒光標(biāo)記、熱穩(wěn)定Taq DNA聚合酶的引入等革命性進(jìn)展，但這些方法都無法實(shí)現(xiàn)臨床高通量測序。此后，人類基因組測序向著更快，更便宜的測序儀的競賽，俗稱“1000美元基因組“。除了孔測序（Oxford Nanopore）方法通過使用蛋白質(zhì)納米孔直接測序而無需DNA合成或擴(kuò)增，大多數(shù)測序平臺使用高通量方法，即原始樣本（用于基因組測序的DNA或用于外顯子組測序的RNA復(fù)制為cDNA）被片段化并固定在擴(kuò)增的單個(gè)細(xì)胞中，然后循環(huán)復(fù)制標(biāo)記的核苷酸，每個(gè)反應(yīng)都被單獨(dú)檢測熒光或H+（離子激流平臺），最后，將每個(gè)序列與參考基因組或外顯子組進(jìn)行比較以進(jìn)行鑒定。

測序ncRNA的技術(shù)挑戰(zhàn)。ncRNA長度異質(zhì)性和外顯子組成給測序帶來巨大挑戰(zhàn)，其大小范圍跨越22-22.7kb。短序列讀取如表達(dá)序列標(biāo)簽（EST），即單個(gè)cDNA克隆僅在其3'端進(jìn)行測序，由此產(chǎn)生數(shù)百個(gè)核苷酸的讀取，這些核苷酸作為完整序列的“標(biāo)簽”轉(zhuǎn)錄本。這種方法適用于構(gòu)建表達(dá)序列的遺傳圖譜和物理圖譜，但它不能檢測出CDS突變的所有豐度（用于癌癥研究）或顯示lncRNA的復(fù)雜剪接模式，如相對“短”的3.8 kb ANRIL卻被表示為50多個(gè)線性或圓形的剪接同工型。采用經(jīng)典的分子生物學(xué)方法，即使用隨機(jī)引物進(jìn)行RT反應(yīng)，然后通過5'/ 3'RACE（cDNA末端的快速擴(kuò)增）技術(shù)進(jìn)行序列的擴(kuò)增可以避免上面這些問題，但是在這個(gè)情況下要想覆蓋絕大多數(shù)lncRNA基因組信息，不僅需要開發(fā)能夠提供更長和更準(zhǔn)確讀數(shù)的新型測序硬件，而且還需要提高逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）盡可能復(fù)制全長序列的能力。另一方面，對于小miRNA，可以通過凝膠純化小RNA的一部分，用T4 RNA連接酶將它們添加到5'和3'銜接子，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR來對整個(gè)組織群體進(jìn)行測序。這樣，即使對于低表達(dá)的miRNA，也可以獲得代表性的結(jié)果。此外，因?yàn)樽x取次數(shù)與初始miRNA拷貝數(shù)成正比，在處理miRNA時(shí)，新的高通量測序技術(shù)可以提供miRNA物種的單核苷酸分辨率，有助于二次miRNA的識別并提供miRNA定量的動態(tài)范圍。

3    MicroRNAS（miRNA），多效翻譯調(diào)控家族

MiRNA是長度不超過22個(gè)核苷酸的小RNA，在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中起重要作用。MiRNA基因在轉(zhuǎn)錄控制之下，由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄并經(jīng)歷由pri-miRNA初級轉(zhuǎn)錄本到功能齊全的成熟miRNA過程，包括RNase III內(nèi)切核糖核酸酶DROSHA和DICER。近年來，Alles等人估計(jì)全人類miRNA組由2300個(gè)miRNA組成，miRbase數(shù)據(jù)庫第22版本中則注釋了1115個(gè)成熟miRNA。MiRNA通過與mRNA的3'UTR處進(jìn)行堿基配對來靶向mRNA，從而通過RISC復(fù)合物（RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物）降解mRNA或?qū)崿F(xiàn)翻譯阻遏。據(jù)報(bào)道，超過60％的mRNA在其3'UTR處帶有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，說明這種相互作用對于精細(xì)調(diào)節(jié)翻譯十分重要。由于miRNA /mRNA互補(bǔ)只需要6個(gè)堿基配對形成雙鏈體，因此單個(gè)miRNA可以靶向數(shù)十種不同的mRNA，而這些mRNA又可以被許多不同的miRNA調(diào)節(jié)，因此使得miRNA的功能相當(dāng)復(fù)雜。

3￠UTR的動力學(xué)：miRNA功能不止一個(gè)。mRNA的3￠UTR區(qū)在長度和序列上具有高度多態(tài)性，奠定了miRNA靶點(diǎn)變化和相關(guān)mRNA穩(wěn)定性的基礎(chǔ)。3￠UTR的長度多態(tài)性是由于兩種不同的機(jī)制引起的：非翻譯區(qū)外顯子的選擇性剪接（與大多數(shù)RNA一樣）和替代性聚腺苷酸化（主要限于mRNA，lincRNA和NAT）的存在。Liaw等人研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞表達(dá)的3￠UTR比正常細(xì)胞要短，這表明3￠UTR延長可能導(dǎo)致miRNA位點(diǎn)失調(diào)，因此不僅應(yīng)將3￠UTR區(qū)作為miRNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行研究，而且應(yīng)將其作為動態(tài)結(jié)構(gòu)研究，因?yàn)?/span>3￠UTR變化可能導(dǎo)致新的危險(xiǎn)因素或新的疾病候選基因的發(fā)現(xiàn)。Navarro等人研究發(fā)現(xiàn)3￠UTR調(diào)節(jié)miRNA活性。研究表明，AAMDC的3￠UTR起源于兩個(gè)長度不同的同工型，只有長的同工型對miR-2428/664a沉默敏感；Bruhn等人在ABCB1基因中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)不同的3￠UTR長度變異體，其中只有3個(gè)較長片段帶有miRNA結(jié)合位點(diǎn)；Pereira等人的研究發(fā)現(xiàn)來自核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子Nurr1（NR4A2）mRNA中存在許多3￠UTR長度變異，而miR-93，miR-204和miR-302d也對Nurr1（NR4A2）mRNA具有選擇性相互作用。作者的研究也發(fā)現(xiàn)，在鼠Cd34基因的內(nèi)部隱蔽剪接位點(diǎn)發(fā)生的剪接事件將調(diào)節(jié)miRNA-125/351對Cd34mRNA的3￠UTR或CDS的差異性結(jié)合（圖2）。

圖2. 3'UTR的結(jié)構(gòu)變化影響特定miRNA的結(jié)合。1.替代性聚腺苷酸化信號的存在導(dǎo)致不同長度的3'UTR和miRNA結(jié)合潛力不同。2. 3'UTR的不同剪接方式使得與miRNA結(jié)合的潛力不同。3.外顯子開關(guān)。就Cd34基因而言，內(nèi)部隱蔽剪接位點(diǎn)（CSS）激活了兩個(gè)不同的終止密碼子，并產(chǎn)生了兩個(gè)不同的外顯子，在一個(gè)Cd34同工型中，多數(shù)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)位于3'UTR中，而在另一個(gè)同工型中，其位于CDS內(nèi)部。

 ATH進(jìn)展中的MicroRNA。關(guān)于ATH進(jìn)化的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究已相當(dāng)多，已證實(shí)miRNA參與了ATH發(fā)生的許多病理過程，許多miRNA是脂質(zhì)處理，炎癥和細(xì)胞行為（如增殖，遷移和表型轉(zhuǎn)換）的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。不僅在原組織中，而且在血清，尿液和外泌體中都檢測到miRNA表達(dá)的改變。關(guān)于人類患者或ATH小鼠模型中miRNA表達(dá)調(diào)節(jié)的研究也有眾多，而且有部分研究已經(jīng)涉及到機(jī)制研究。表2列出了動物模型或人類患者樣品中ATH相關(guān)的miRNA，以及通過熒光素酶報(bào)告基因分析（并非生物信息學(xué)預(yù)測）驗(yàn)證的其mRNA靶標(biāo)及其表達(dá)改變對ATH進(jìn)程的影響，強(qiáng)調(diào)了miRNA /mRNA系統(tǒng)的復(fù)雜性，如同一mRNA的不同miRNA（例如miR-103和miR-647與PTEN）和單個(gè)miRNA靶向不同mRNA（miR-370與FOXO1和TLR4）。

表2. ATH相關(guān)miRNA、mRNA靶標(biāo)以及它們的表達(dá)對ATH進(jìn)展的影響

基因沉默療法中的小RNA。基因沉默中是基于小RNA的療法，通過靶向藥物無法到達(dá)的靶標(biāo)或多基因病理學(xué)中的mRNA達(dá)到疾病治療目的。針對miRNA的基因沉默方法包括激動劑或單鏈miRNA（ss-miRNA）和激活劑（含有互補(bǔ)序列的靶向miRNA序列的寡核苷酸），雙鏈小干擾RNA（ds-siRNA）或miRNA海綿。針對ATH的RNA治療目前已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)中。Patisiran作為第一款RNAi藥物，可以使運(yùn)甲狀腺素蛋白（TTR）mRNA沉默，治療罕見的運(yùn)甲狀腺素蛋白介導(dǎo)的淀粉樣變性多發(fā)性神經(jīng)病。其他基于miRNA用于醫(yī)學(xué)干預(yù)的藥物目前正在臨床開發(fā)中或處于1期或2期臨床試驗(yàn)中，例如MRG-110是針對miR-92的鎖定核酸（LNA）修飾的反義寡核苷酸，用于傷口愈合和心力衰竭的治療中；Remlarsen是一種miR-29b模擬物，可防止形成纖維化疤痕或皮膚纖維化；拮抗miR-21的寡核苷酸，可以緩解Alport腎病小鼠模型中的腎臟疾病。此外，這些miRNA模擬物或拮抗劑也應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室中調(diào)節(jié)ATH研究中miRNA的表達(dá)，還有針對miR-449a、miR-23a-5p或miRNA-98等在動物模型中的治療研究，也取得了理想的結(jié)果。最后，治療性miRNA不僅限于靶向特定的mRNA或miRNA，而且還被用作輔助因子，通過沉默促進(jìn)藥物低生物利用度的關(guān)鍵蛋白質(zhì)達(dá)到降低耐藥性的目的。

miRNA在基因沉默或基因模擬療法中的應(yīng)用仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，比如合適的遞送方式，以減少不必要的靶標(biāo)副作用，或阻止免疫激活。miRNA/siRNA遞送載體的主要缺點(diǎn)如由于ds-siRNA的剛性導(dǎo)致負(fù)載的siRNA量的限制，以及由于siRNA表面電荷低而導(dǎo)致封裝困難。此外，與脂質(zhì)納米顆粒，陽離子復(fù)合物，無機(jī)納米顆粒，RNA納米顆粒和樹狀聚合物的常規(guī)絡(luò)合或包封由于引入了大量的媒介物，導(dǎo)致潛在的免疫原性反應(yīng)或毒性。而miRNA藥物直接注射的方式由于提高了靶標(biāo)的特異性和沉默功效，并最大程度減少了副作用而受到青睞。因此，許多化學(xué)修飾物的開發(fā)例如硫代磷酸酯，2'-O-methyl、LNA（鎖核酸）等可以增加DNA / RNA部分的穩(wěn)定性。此外，針對具體運(yùn)送方式的研究也越來越多，例如加入針對靶細(xì)胞蛋白質(zhì)的特異性抗體并連接到遞送載體上可以增強(qiáng)治療功效，或“ TargomiRs”，通過靶向細(xì)菌的小型細(xì)胞來模擬miRNA。

此外，miRNA/siRNA由于與非靶標(biāo)的3￠UTR端互補(bǔ)結(jié)合而導(dǎo)致脫靶效應(yīng)，由此帶來了藥物副作用。據(jù)報(bào)道，在一項(xiàng)ApoE^-/-小鼠致ATH的模型中抗CD40-siRNA的全身治療增加了腎NF-kB中的激活；一項(xiàng)使用miRNA-34的模擬物（MRX34）來抗腫瘤的1期試驗(yàn)，因?yàn)橛?名患者出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫反應(yīng)而于2016年叫停；在一項(xiàng)TargomiR-16靶向EGFR治療惡性胸膜間皮瘤的1期試驗(yàn)中，出現(xiàn)了輸注相關(guān)的炎癥綜合征和心臟事件。這說明，miRNA/siRNA還需要進(jìn)一步研究RNA運(yùn)輸載體、免疫反應(yīng)以及寡核酸引起的炎癥反應(yīng)等副作用。

4   長非編碼RNA（lncRNA）及其與miRNA的功能關(guān)系

LncRNA和miRNA海綿。長非編碼RNA（lncRNA）是轉(zhuǎn)錄本> 200個(gè)核苷酸的ncRNA，可以通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄等多種不同機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)或轉(zhuǎn)錄后水平。LncRNA協(xié)調(diào)并整合多種信號通路，并在發(fā)育，分化和疾病中起重要作用。人類中l(wèi)ncRNA基因的數(shù)量是蛋白質(zhì)編碼基因數(shù)量的兩倍以上，目前估計(jì)超過56,000，但由于它們的表達(dá)水平低，仍然有許多LncRNA未被發(fā)現(xiàn)和注釋。根據(jù)其假定功能，lncRNA已分類為許多功能組：競爭性內(nèi)源lncRNA（ceRNA）和具有潛在miRNA抑制作用的環(huán)狀lncRNA（circRNA），參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的與增強(qiáng)子相關(guān)的RNA（eRNA），超保守RNA（T-UCR），高度異質(zhì)的天然反義轉(zhuǎn)錄本（NAT），內(nèi)含子lncRNAs和長基因間RNA（lincRNA）等。

 LncRNA在ATH進(jìn)展和治療中的作用。ANRIL。高通量測序已發(fā)現(xiàn)了一些與ATH發(fā)病相關(guān)的lncRNA(表3)，其中CDKN2B-AS1，也稱為ANRIL（INK4基因座中的反義非編碼RNA），已明確了在ATH中的致病機(jī)制，它是從9p21染色體轉(zhuǎn)錄而來，作為lncRNA向?qū)RC通過直接與其亞基CBX7或SUZ12相互作用的方式定位于啟動子上。ANRIL是由NF-kB途徑的激活誘導(dǎo)的，上調(diào)的ANRIL與轉(zhuǎn)錄因子Yin Yang 1（YY1）形成功能復(fù)合物發(fā)揮對內(nèi)皮細(xì)胞中的炎癥因子IL6和IL8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而敲低ANRIL可以抑制TNFα誘導(dǎo)的IL6和IL8表達(dá)，說明ANRIL參與了TNFα/NF-kB信號中炎癥的表達(dá)。ANRIL也與增殖型的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）有關(guān)，并通過Alu重復(fù)元件調(diào)控促動脈粥樣硬化的其他基因的表達(dá)。已有報(bào)道ANRIL以miRNA海綿的作用在不同的腫瘤中發(fā)揮作用，例如三陰性的乳腺癌中的miR-199a，宮頸癌中的miR-186或小兒髓母細(xì)胞瘤中的miR-323等。

表3. ATH進(jìn)展中的lncRNA：miRNA:mRNA軸

轉(zhuǎn)錄的超保守RNA（T?UCR）。Evf-2是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的T-UCR RNA，由基因Dlx-5和Dlx-6的主域之間的超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來。在功能水平上，Efv-2充當(dāng)Dlx-2的共激活因子，增加了Dlx-5/6簇的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的活性。T-URCs的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特定CpG島上，許多T-UCR RNA如Uc.160+，Uc283+ A，Uc.346+，通過DNA甲基化而被沉默。在腫瘤中發(fā)現(xiàn)了大量T-UCR，如腎細(xì)胞癌中的Uc.416+A，大腸癌中的Uc.383、Uc.338或乳腺癌中的Uc.63。T-UCR和miRNA之間具有相互調(diào)控作用，如Uc.283+A與pri-miR-195直接相互作用阻止了Drosha的切割并阻礙了它的成熟；miRNA-195或miR-29b的Uc.173可以促進(jìn)腸道上皮的功能，Uc.416+A與miR-153在腎細(xì)胞癌中相互作用。

天然反義轉(zhuǎn)錄本（NAT）。NATs是高度異質(zhì)的lncRNA，從反義方向由靶基因的互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄而來，通過RNA的方式與mRNA或miRNA相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，基因FOXD1的反義轉(zhuǎn)錄物lncRNA FOXD1-AS1（FOXD1-反義1）與miR339-5p和miR342-3p相互作用，抑癌劑TP73-AS1與miR-941相互作用，而TSPAN31，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的天然反義轉(zhuǎn)錄物在肝細(xì)胞癌中與miR-135b相互作用，導(dǎo)致TSPAN31沉默以及隨后的CDK4的上調(diào)。

基因組元件的逆向作用：假基因和Alu重復(fù)元素。逆向基因組元件是一組異質(zhì)表達(dá)的mRNA，如逆向轉(zhuǎn)錄（從mRNA到cDNA）的循環(huán)，以及由LINE逆轉(zhuǎn)座子中的逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸內(nèi)切酶活性催化的插入（cDNA進(jìn)入基因組DNA）。其中最有特色的是經(jīng)過加工的假基因，其源于功能性mRNA的逆向作用，以及Alu家族的重復(fù)序列，Alu家族是短SINEs組成員，源自Alu元素。

加工過的假基因3'-末端多聚腺苷酸化，由于來自完全剪接的轉(zhuǎn)錄本，所以不包含內(nèi)含子，由長度為5至20 bp的重復(fù)整合位點(diǎn)排列，在基因組整合后其序列發(fā)生變性。假基因曾經(jīng)被認(rèn)為是“垃圾DNA”，因?yàn)樗鼈兪チ司哂芯幋a功能的基因（mRNA），但最近研究發(fā)現(xiàn)它們在基因表達(dá)和調(diào)控中發(fā)揮作用。假基因失調(diào)通常與各種包括癌癥在內(nèi)的人類疾病相關(guān)。據(jù)估計(jì)，人類基因組中已加工的假基因的數(shù)量與“真實(shí)”編碼基因的數(shù)量相似，且部分假基因已證實(shí)具有miRNA海綿作用。雖然某些假基因被認(rèn)為是miRNA海綿，但有些因素可能會影響假基因在miRNA功能中的作用。如，假基因在基因組中整合后的序列變性可能會使miRNA結(jié)合位點(diǎn)失活，而整合位點(diǎn)后的基因組可能會產(chǎn)生與親本基因不同的表達(dá)模式。而且，親本基因及其假基因后代之間的基因數(shù)量存在差異，并非所有基因都具有其相應(yīng)表達(dá)的假基因，但假基因數(shù)目卻非常多，在79個(gè)編碼人核糖體蛋白的基因中發(fā)現(xiàn)了2090個(gè)假基因，其中145個(gè)假基因與RPL21相對應(yīng)。目前有研究小組將假基因視為miRNA海綿創(chuàng)建了一個(gè)手動管理的數(shù)據(jù)庫（miRsponge）。如，錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)組件假基因2（PMS2L2）被視為miR-203在骨關(guān)節(jié)炎中的分子海綿，其中MCL-1 mRNA是miR-203的直接靶標(biāo)；鐵蛋白重鏈1假基因3（FTH1P3）抑制miR206活性促進(jìn)了ABCB1（ATP結(jié)合盒亞家族B成員1成員）蛋白表達(dá)，并抑制了miR-224-5p的表達(dá)。此外，OCT4-假基因4可以保護(hù)OCT4 mRNA免受miR-145的破壞，PTENp1（PTEN假基因1）被認(rèn)為可以屏蔽PTEN mRNA防止口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）中的miR-21以及胃腫瘤中的miR-106b和miR-93的破壞。

短穿插核元件（SINEs）也屬于逆向基因組并起miRNA海綿功能的RNA暗轉(zhuǎn)錄本。SINE包括Alu重復(fù)序列，其中超過10％（即一百萬個(gè)拷貝）由Alu衍生的序列組成，以致于成功定居于人類基因組中。Alu重復(fù)序列通過使用LINEs中編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶整合到人類基因組中，隨后發(fā)生序列變性，轉(zhuǎn)位能力失活，僅少數(shù)保留活性?；蚪MAlu元件在左臂的5'端包含一個(gè)RNA聚合酶III內(nèi)部啟動子，在右臂的3'端包含一個(gè)短的poly-A尾。雖然Alu家族的大多數(shù)成員在人類基因組中沉默了，但其中一些仍被RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄成游離Alu RNA（作為單個(gè)Alu-RNA的連接體，其機(jī)制尚不清楚），或被RNA pol-II轉(zhuǎn)錄為mRNA嵌入了Alus，這是自aprox以來表達(dá)的Alu元素的重要來源。30％的人類基因通常在其5'或3'UTR處帶有Alu重復(fù)序列（圖3）。由于Alu重復(fù)序列具有自由轉(zhuǎn)錄本或插入了mRNA的序列，因此Alu元件與miRNA之間的功能關(guān)系十分復(fù)雜，但在不同的mRNA中存在高度同源的Alu重復(fù)序列，這些序列可以為miRNA的協(xié)同靶向作用或miRNA海綿作用提供共同的結(jié)合位點(diǎn)。據(jù)報(bào)道3'UTR亞單元包括Alu元件具有50多種不同的miRNA的潛在靶點(diǎn)，有30種miRNA的短的種子序列與人類mRNAs 3'UTRs上高度保守的Alu序列具有同源性。此外，最近顯示miR-15a-3p和miR-302d-3p僅在Alu元素內(nèi)靶向RAD1，GTSE1，NR2C1，F(xiàn)KBP9和UBE2I，而miR661通過與Alu元素相互作用而導(dǎo)致Mdm2和Mdm4的下調(diào)，有學(xué)者也發(fā)現(xiàn)了一種可充當(dāng)miR-566海綿的Alu RNA。

圖3. Alu元素在miRNA活性調(diào)節(jié)中的作用。Alu元素在獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單元下可以轉(zhuǎn)錄自自身的RNA pol III啟動子（左），也可以在整合到另一個(gè)基因中時(shí)由RNA pol II啟動子轉(zhuǎn)錄而來。這兩種情況它們都可以充當(dāng)miRNA海綿來與miRNA相互作用。一些單獨(dú)的Alu元素可以反插入基因間區(qū)域或其他轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)部。

5   動脈粥樣硬化進(jìn)展中的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

構(gòu)建mRNA和miRNA（以及l(fā)ncRNA）在內(nèi)的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對于ATH研究是很有必要的。miRNAom調(diào)控mRNA穩(wěn)態(tài)水平，而lncRNA海綿維持miRNA的調(diào)節(jié)水平。首先，需要識別特定miRNA的mRNA靶標(biāo)，方法是提取雜交雙鏈體。miRNA/靶標(biāo)交聯(lián)和免疫沉淀（CLIP）分析方法-測序是比較常用的方法，例如HITS-CLIP，miR-CLIP，AGO-RIP-Seq，LIGR-Seq，Biotin-Pulldown和RNA-seq等，鑒定出miRNA/mRNA對后，通過螢光素酶測定方法證實(shí)相互作用，即將測試的mRNA的3￠UTR克隆到螢光素酶基因的下游，通過構(gòu)建體發(fā)出的光的變化來表示miRNA的表達(dá)。但是，這些方法均存在一定缺點(diǎn)，比如復(fù)雜、耗時(shí)等等，因此目前大多數(shù)miRNA通過獲得序列、結(jié)構(gòu)或熱力學(xué)特征后，使用生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA/mRNA相互作用并預(yù)測miRNA靶標(biāo)。近年來，預(yù)測miRNA靶標(biāo)的算法和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器激增（表4），但這些預(yù)測也常常出現(xiàn)不一致，不準(zhǔn)確等不足，因此輔助算法誕生，即通過結(jié)合許多主要目標(biāo)預(yù)測的輸出來執(zhí)行更全面的分析（例如，miRSystem結(jié)合了七個(gè)主要算法，而miRWalk2.0則將其中的12個(gè)結(jié)合在一起），并可以通過設(shè)置匹配數(shù)來控制搜索的嚴(yán)格度，但這些分析的輸出也是一長串的預(yù)測目標(biāo)。集成/富集分析則適用于處理這些較長的基因列表。在綜合分析中，通過附加條件獲得預(yù)測目標(biāo)列表，接下來將單個(gè)miRNA或miRNA預(yù)測靶標(biāo)的列表與來自相同實(shí)驗(yàn)背景的差異表達(dá)基因（DEG）的列表進(jìn)行比較或與表達(dá)存儲庫如GEO數(shù)據(jù)庫比較，那些與miRNA表達(dá)水平成反比的靶標(biāo)將整合到限定列表中。采用上述方法，張等人構(gòu)建了一個(gè)miRNA：mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，即用蓖麻油處理的高脂喂養(yǎng)的ApoE缺陷小鼠中的ATH，miRNA表達(dá)的變化主要影響病變中的PI3K/Akt，Ras，ErbB和VEGF信號通路。

表4. miRNA靶標(biāo)的預(yù)測方法和miRNA/mRNA相互作用的整合分析。

GO富集分析將差異表達(dá)基因（DEG）中的單個(gè)基因進(jìn)行分類歸納，可以發(fā)現(xiàn)那些具有共同功能的類別，把互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步細(xì)化到結(jié)構(gòu)通路或分子功能。對ATH-DEG的GO分析發(fā)現(xiàn)了與核酸功能相關(guān)的蛋白質(zhì)富集，例如表觀遺傳調(diào)節(jié)劑，[肝X]核受體或核糖體蛋白，作者在ATH中的綜合分析也發(fā)現(xiàn)了與核酸功能相關(guān)的基因富集。

最后，lncRNA的識別增加了這種互作網(wǎng)絡(luò)分析的難度，因?yàn)閘ncRNA功能異質(zhì)性大，可以充當(dāng)miRNA海綿發(fā)揮不同作用，還可以與miRNA競爭共同的mRNA靶標(biāo)，或者與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用，影響其功能表征。此外，由于大多數(shù)lncRNA功能尚未注釋，因此單個(gè)lncRNA功能的信息很少且不完整，作用機(jī)制不明。但是，目前已有研究報(bào)道了在ATH中miRNA：mRNA：lncRNA互作網(wǎng)絡(luò)（表3）。

6    臨床中的暗轉(zhuǎn)錄組：未來的挑戰(zhàn)

人類基因組的完成使人類認(rèn)識到暗轉(zhuǎn)錄組（由“垃圾” DNA編碼）屬于調(diào)節(jié)性RNA，其中許多與人類疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。在臨床背景下推動ncRNA革命，探索其作為特定生物標(biāo)志物或致病性中間體的作用是人類面臨的巨大挑戰(zhàn)，這需要在測序信息的產(chǎn)生，管理和解析方式上進(jìn)行新的技術(shù)開發(fā)。測序技術(shù)的理念是“更快，更長，更便宜”，下一代測序儀則應(yīng)增加對準(zhǔn)確性的重視。按照臨床分析標(biāo)準(zhǔn)對ncRNA進(jìn)行測序并不是一件容易的事，需要極高的準(zhǔn)確性和靈活性。準(zhǔn)確性是因?yàn)閚cRNA中的點(diǎn)突變（對癌癥研究至關(guān)重要）不能被用于擴(kuò)增和產(chǎn)生序列的試劑或用于檢測序列的機(jī)器的噪聲所損害，并且多重測序會大大增加成本。靈活性是因?yàn)閚cRNA的大小和結(jié)構(gòu)變異性大，且存在許多可變剪接事件導(dǎo)致的多個(gè)同源形式，因此從短序列重建長序列是一個(gè)挑戰(zhàn)，對于富含簇狀重復(fù)序列（例如Alu重復(fù)序列）的基因組區(qū)域測序同樣需要做到上面兩點(diǎn)。但未來測序技術(shù)已表現(xiàn)出創(chuàng)新性和動態(tài)性。

在臨床環(huán)境中引入ncRNA表達(dá)譜的第二大挑戰(zhàn)是測序信息管理和使用的方式。首先，需要以易于檢索的方式存儲，而且需要開發(fā)新的軟件，創(chuàng)建新的醫(yī)學(xué)或者生物學(xué)相關(guān)的窗口易于提取數(shù)據(jù)，此外，要做到數(shù)據(jù)兼容性和標(biāo)準(zhǔn)化。市場上以及未來不同的測序平臺應(yīng)努力實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享。另一方面，整個(gè)基因組/轉(zhuǎn)錄組水平的數(shù)據(jù)解析和挖掘則需要使用人工智能和深度學(xué)習(xí)算法。基因組數(shù)據(jù)集龐大且復(fù)雜，需要新的有效分析工具，數(shù)據(jù)科學(xué)的深入學(xué)習(xí)將對基因組探索和挖掘起到重要作用。深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)Splice AI已被用來預(yù)測mRNA前體的轉(zhuǎn)錄物，以及具有引起隱蔽剪接事件能力的非編碼變異體，未來可能還會開發(fā)出許多類似的智能工具來輔助解析整個(gè)轉(zhuǎn)錄組/基因組。

人類正在以一種新的方式看待疾病、正常，未患病的狀態(tài)。疾病與基因組DNA的突變或編碼mRNA表達(dá)的改變有關(guān)，但是，現(xiàn)在這個(gè)“編碼世界”只是基因表達(dá)的冰山一角，因?yàn)榉蔷幋aRNA的數(shù)量多于編碼RNA的數(shù)量，而且所有這些RNA在編碼基因之間（以及與染色質(zhì)）相互作用，形成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)性miRNA / lncRNA / mRNA網(wǎng)絡(luò)，這種失衡將是復(fù)雜疾病的基礎(chǔ)。因此，建立準(zhǔn)確的疾病模型、開發(fā)新的個(gè)性化治療方法需要測序技術(shù)的創(chuàng)新以獲得準(zhǔn)確的測序數(shù)據(jù)，而且需要該測序數(shù)據(jù)易于管理以及公開透明，以深度挖掘潛在的miRNA/lncRNA/mRNA互作網(wǎng)絡(luò)，為人類疾病做出突破性貢獻(xiàn)。

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