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編譯：YQ，編輯：夏甘草、江舜堯。 原創(chuàng)微文，歡迎轉發(fā)轉載。 導讀
單細胞測序（SCS）影響了許多癌癥研究領域，并提高了研究人員對腫瘤內(nèi)異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境、轉移和治療耐藥性的理解。SCS技術的發(fā)展和完善使成本大幅降低，細胞通量增加，重現(xiàn)性提高，為臨床應用鋪平了道路。然而，在實現(xiàn)轉化應用之前，必須克服一些技術挑戰(zhàn)。本綜述討論了過去的癌癥研究、新興技術以及未來的臨床應用，這些都將改變癌癥醫(yī)學。
原名：Advancing Cancer Research and Medicine with Single-Cell Genomics 譯名：單細胞基因組學推進癌癥和醫(yī)學研究 期刊：Cancer Cell IF：26.602 發(fā)表時間：2020.04 通訊作者：Nicholas Navin 通訊作者單位：美國麻省理工大學安德森癌癥中心 DOI號：10.1016/j.ccell.2020.03.008 1 當前和新興的技術 近年來SCS的商業(yè)化為腫瘤研究和臨床應用提供了穩(wěn)定的平臺（表1）。微液滴系統(tǒng)已成為高通量scRNA-seq（例如10x Genomics）應用最廣泛的平臺，能夠在一次實驗中分析多達10000個細胞。然而，其他的研究平臺，如納米孔、組合索引和高通量熒光激活細胞分選（FACS）可提供額外功能，包括細胞成像、細胞選擇、降低成本以及多步化學反應。例如，為了在單個細胞中進行全長mRNA分析，可以使用基于FACS的smart-seq2或基于納米孔的平臺來研究選擇性剪接。其他平臺，如組合索引（sci-RNA-seq）可以實現(xiàn)非常高的擴展性（數(shù)百萬個細胞），用于檢測稀有細胞亞群，例如循環(huán)腫瘤細胞（CTC）、癌癥干細胞等。總的來說，scRNA-seq方法代表了最成熟的SCS方法。然而，它們?nèi)匀淮嬖谝恍┘夹g限制，包括低表達基因的轉錄缺失、細胞總基因計數(shù)較低和3’端覆蓋率的偏好。對于表觀遺傳學分析，單細胞ATAC測序（scATAC-seq）是最廣泛使用的檢測單個細胞染色質(zhì)可及性的方法。在scATAC-seq技術的早期研究中，使用流式細胞儀和標記化學或微流控平臺（如Fluidgm）在低細胞通量（96個細胞）下進行實驗。然而，scATAC-seq（10x Genomics）微液滴平臺的開發(fā)，使其成為在單個實驗中分析超過10K個細胞的最受歡迎的平臺。組合索引（dscATAC-seq）也采用了scATAC-seq方法，實現(xiàn)非常高的擴展性，以較低的成本對數(shù)十萬個細胞進行分析。與scRNA-seq相比，scATAC-seq的一個主要優(yōu)點是它可以提供對基因調(diào)控和轉錄或其他因子的更深入的了解，以及提供關于細胞譜系和特征的更多信息。然而scATAC-seq方法仍然受到技術的限制，包括數(shù)據(jù)少和對組織分離高度敏感。另一種方法是使用單細胞亞硫酸氫鹽測序（scBS-seq）和單細胞還原亞硫酸氫鹽測序（scRRBS）等方法測量單個細胞中DNA的胞嘧啶甲基化。雖然單細胞DNA甲基化對于表觀基因組分析和譜系追蹤是非常理想的，但是目前的方法仍然面臨著技術問題的挑戰(zhàn)，包括細胞通量低和基因組覆蓋率低。因此，這些單細胞表觀遺傳的方法對于分析單個癌細胞仍然是不成熟的。
表1 高通量單細胞測序技術 對于高通量scDNA-seq，使用微滴系統(tǒng)開發(fā)了幾個商業(yè)平臺（10x Genomics，Mission Bio）。此外，還開發(fā)了許多研究平臺，包括高密度FACS分析、微流控平臺、納米孔系統(tǒng)和組合索引法等，并提供了更高的擴展性，支持細胞選擇，成本更低，并為定制化學步驟提供更大的靈活性。目前，scDNA-seq最常見的應用是拷貝數(shù)變異（CNA）分析。盡管高通量系統(tǒng)，如微滴（10x Genomics）和組合索引可以實現(xiàn)非常高的通量（高達10K個細胞）用于單細胞CNA分析，但它們面臨著數(shù)據(jù)質(zhì)量較低和基因組分辨率有限的挑戰(zhàn)。相比之下，利用標記化學的納米孔、FACS和微流控平臺可以以單分子分辨率提供非常高質(zhì)量的拷貝數(shù)數(shù)據(jù)，但具有適度的通量（數(shù)百到1000個細胞）。scDNA-seq的另一個主要應用是突變檢測，它需要對突變位點進行更高的深度覆蓋。雖然最初的研究使用WGA的方法對單個細胞進行全基因組或外顯子組測序，但由于成本高昂，這些研究僅限于對少數(shù)細胞進行分析。為了降低成本和提高通量，后續(xù)的研究方法將重點放在對基因組的目標區(qū)域進行測序，例如癌癥基因組合，來增加深度并降低成本。為了進一步將scDNA-seq擴大到10K以上的細胞進行突變檢測，研究人員開發(fā)了一種兩步微滴法（Mission Bio），該方法對數(shù)百個目標基因組區(qū)域的單個細胞進行PCR擴增分析。這種高度針對的方法是理想的臨床應用，但在發(fā)現(xiàn)和推斷癌癥演變的研究中應用有限。必須克服的技術限制包括突變分析的高等位基因丟失率（10%-20%）、無偏檢測的高假陽性以及覆蓋深度不均勻。一些新興技術即將出現(xiàn)，并有可能改變SCS的領域。多組學SCS方法旨在從同一個單細胞（如DNA和RNA、RNA和ATAC）或所有三層的多個分子信息整合起來。這些方法可以為基因型-表型關系和表觀基因組學調(diào)控基因表達提供更深入的見解。雖然最初的技術已經(jīng)證明在同一細胞中對DNA和RNA進行測序的技術可行性，但它們目前的通量低、成本高。使用納米孔系統(tǒng)、微液滴平臺和組合索引，這些方法的未來發(fā)展有望克服許多這些技術障礙，這可能導致它們在不久的將來廣泛應用于癌癥研究。另一種新興技術是空間分辨的SCS。標準SCS方法的一個主要局限性是它們需要預先制作細胞懸液，因此在分離過程中丟失了細胞在其固有組織環(huán)境中位置的所有空間信息。為了保存空間信息，激光捕獲顯微切割（LCM）可與scDNA-seq或scRNA-seq相結合。但是LCM方法處理的細胞量較低（<100個細胞）。其他方法，如空間轉錄組微陣列和Slide-Seq是高通量的，可以在數(shù)千個空間位置對一小部分細胞測序（10-100個細胞），但沒有單細胞的分辨率。相比之下，原位測序技術，包括FISSEQ、MERFISH和seqFISH具有單細胞分辨率，但只能對有限的空間區(qū)域成像，并且受限于較小的目標基因。這些空間技術的進一步發(fā)展將極大地提高我們對癌癥生物學的理解，并有望通過將組織的定性和形態(tài)學特征與單細胞分辨率的基因組數(shù)據(jù)聯(lián)系起來，徹底改變臨床病理學。 2 癌癥研究 迄今為止，使用SCS發(fā)表的癌癥研究大致可分為五個主要領域：（1）癌前病變的侵襲；（2）原發(fā)腫瘤的克隆進化和瘤內(nèi)異質(zhì)性（ITH）；（3）腫瘤微環(huán)境的重組；（4）轉移性擴散；（5）治療性耐藥（圖1A）。在這些研究中，scRNA-seq和scATAC-seq方法通常被用來解析腫瘤微環(huán)境（TME）中的細胞類型和細胞狀態(tài)，以及腫瘤細胞的表達模式和亞型。對TME中細胞狀態(tài)的分析可以揭示不同的基質(zhì)細胞和免疫細胞是如何被重新編程的，反映促進或抑制腫瘤生長的不同生物學功能（圖1B）。同樣，scRNA-seq方法可以通過分析增殖、干細胞性、缺氧、上皮-間充質(zhì)轉換（EMT）、代謝和其他癌癥標志的基因特征，深入了解腫瘤細胞的表型多樣性。scRNA-seq相對于普通RNA-seq的一個優(yōu)點是能夠進行細胞類型特異性差異表達分析，以確定TME中的細胞類型是否在治療或進展等條件下表達不同的基因。其他分析可能包括重建分化譜系或以單細胞分辨率識別腫瘤表達亞型（如PAM50）（圖1B）。一些研究小組表明，通過推斷DNA拷貝數(shù)信息來區(qū)分非整倍體腫瘤細胞和TME，并且突變位點（例如外顯子組測序）可用于單細胞全長mRNA數(shù)據(jù)基因分型。然而，這些數(shù)據(jù)非常稀少，RNA數(shù)據(jù)中檢測到的CNA通常與DNA數(shù)據(jù)不相關，因此RNA拷貝數(shù)方法的最佳應用是從正常細胞中對腫瘤細胞進行分類，而不是推斷腫瘤克隆亞結構。scDNA-seq方法可用于在癌前疾病、轉移和治療耐藥的情況下，在腫瘤演化過程中解析克隆亞結構并重建克隆譜系（圖1C）。scDNA-seq的方法特別有助于解決不同腫瘤克隆中的突變共現(xiàn)和相互排斥性問題。研究人員討論了癌癥研究的幾個領域中SCS方法用于闡明癌癥生物學。
圖1 癌癥研究應用與分析 癌前疾病的見解 一個主要的問題是癌前腫瘤如何發(fā)展為侵襲性惡性腫瘤。兩項使用scDNA-seq的研究集中了解了最常見的癌前乳腺癌的問題，即導管原位癌（DCIS）。通過開發(fā)一種稱為地形單細胞測序（TSCS）的空間分辨率的scDNA-seq分析方法，基因組CNA與10例同步DCIS-IDC組織的空間信息相關聯(lián)，表明多個克隆從導管進入侵襲區(qū)域。在一項針對四名DCIS-IDC患者的小型研究中，scDNA-seq數(shù)據(jù)顯示原位腫瘤細胞在侵襲過程中經(jīng)歷了群體瓶頸，導致選定基因型的擴展。雖然這兩項研究都顯示了從DCIS到IDC區(qū)域的直接基因組譜系，但他們報告了在入侵期間克隆基因型選擇的不同結果。在Barrett食管癌和早期胃癌中，兩項研究使用scRNA-seq識別與進展相關的癌前腫瘤細胞中的標記基因。在另一項研究中，scRNA-seq用于比較癌前和晚期胰腺癌之間的TME，顯示在進展過程中促炎性免疫細胞的丟失和重組肌成纖維細胞的增加。這些研究強調(diào)了利用SCS了解癌前病變向侵襲性疾病進展的實用性，在這種情況下，腫瘤細胞通常是很少見的群體，無法用普通基因組學方法進行分析。解析腫瘤微環(huán)境 TME主要分為免疫細胞組分和基質(zhì)細胞組分，這兩種細胞組分都可以用scRNA-seq和scATAC-seq方法解析。在基質(zhì)TME中，成纖維細胞一直是一種備受關注的細胞類型，因為它們通常被重新編程為癌相關成纖維細胞（CAF），已證明與腫瘤細胞相互作用并促進或抑制腫瘤生長。在一些癌癥中，scRNA研究揭示了基質(zhì)構建、血管生成和免疫調(diào)節(jié)中具有不同功能的異質(zhì)CAF亞型。另一種基質(zhì)細胞類型是內(nèi)皮細胞，可重新編程為腫瘤內(nèi)皮細胞（TEC），通過招募血管系統(tǒng)和調(diào)節(jié)免疫細胞來促進腫瘤進展。scRNA-seq的方法可以解析內(nèi)皮細胞的亞型并揭示針對的信號通路。由于免疫療法在癌癥治療中的應用日益廣泛，免疫性顳下頜關節(jié)炎是實體瘤研究的另一個熱點領域。一些研究使用scRNA-seq研究T細胞，并顯示抑制性免疫微環(huán)境與不良預后相關，其中T細胞衰竭特征的增加和T細胞活化的減少與多種人類癌癥的進展相關。此外，scRNA-seq方法表明組織駐留記憶T細胞在乳腺腫瘤中具有更高的細胞毒性，并與三陰性乳腺癌（TNBC）患者的更好預后相關。髓樣細胞是TME的另一個組成部分，與多種癌癥類型的患者預后相關。腫瘤相關巨噬細胞（TAM）傳統(tǒng)上被分類為M1（炎癥）或M2（促腫瘤）亞型；然而，scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，存在一個連續(xù)的巨噬細胞表達程序細胞群，具有大量的細胞狀態(tài)多樣性。scRNA-seq鑒定的其他髓系亞型包括髓源性抑制細胞和單核細胞。值得注意的是，兩項使用scRNA-seq的膠質(zhì)瘤研究表明，TME中與小膠質(zhì)細胞相關的外周巨噬細胞表達程序增加與膠質(zhì)瘤患者的進展和生存率差有關。腫瘤細胞表型的多樣性 腫瘤細胞在增殖、干細胞性、EMT、侵襲、遷移、代謝、免疫逃避、凋亡和缺氧等方面表現(xiàn)出不同的表型。這種多樣性可能在進展、治療反應、侵襲和轉移中起重要作用。與普通基因組方法相比，scRNA-seq和scATAC-seq具有解決腫瘤細胞表型多樣性和可塑性的能力。在膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）中，scRNA-seq鑒定了EMT和干細胞性信號的可塑性，表明大多數(shù)腫瘤由具有不同GBM亞型特征的細胞組成。類似地，在TNBC的snRNA-seq中，雖然基底樣細胞（PAM50）表達亞型通常占主導地位，但在腫瘤中也有許多癌細胞與其他表達特征細胞共存，這些細胞對化療沒有反應。頭和頸部腫瘤的scRNA-seq也發(fā)現(xiàn)了EMT狀態(tài)的變化，其中部分EMT與侵襲和轉移擴散相關。在乳腺癌中，scRNA-seq鑒定了不同患者的EMT、血管生成和干細胞性的表型變異。在TNBC中，scRNA-seq分析確定了與治療耐藥和轉移相關的鞘糖脂代謝特征，并預測了患者的預后。scRNA-seq等方法也可用于推斷人類腫瘤的細胞層次、譜系可塑性和發(fā)育軌跡。在腦腫瘤中使用scRNA-seq方法可以深入了解早期膠質(zhì)瘤（星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞）中腫瘤細胞的分化軌跡，以及侵襲性GBM狀態(tài)之間的動態(tài)可塑性。通過對GBM腫瘤進行空間采樣，另一項scRNA-seq研究顯示，與內(nèi)核相比，腫瘤邊緣附近侵襲性腫瘤細胞顯示出缺氧、低增殖和低粘附性。單細胞多組學研究也揭示了基因突變和轉錄重編程之間的聯(lián)系。通過轉錄組基因分型，研究人員通過比較野生型和突變，確定CALR突變骨髓增生性腫瘤的未折疊蛋白。另一項針對結直腸癌原發(fā)性和轉移性配對樣本的研究使用單細胞“三組分”（DNA、RNA、甲基化）表明，DNA甲基化水平在不同的遺傳譜系中存在差異，但在轉移過程中相對穩(wěn)定。克隆演化 在原發(fā)性腫瘤的增殖過程中，腫瘤細胞經(jīng)過達爾文進化，在選擇性壓力下形成不同的克隆譜系。與scDNA-seq方法相比，普通測序在解決腫瘤中的ITH和克隆譜系方面的能力有限。這些數(shù)據(jù)可以深入了解腫瘤演化的一般模型。scDNA- seq發(fā)現(xiàn)的一個進化模型是乳腺癌中的斷續(xù)拷貝數(shù)進化，它表明基因組不穩(wěn)定性的早期爆發(fā)會導致數(shù)百個基因組位點重排，這些重排會重新穩(wěn)定并經(jīng)歷穩(wěn)定的克隆增殖，挑戰(zhàn)了漸進進化的模式。在乳腺癌、異種移植和卵巢癌中使用單細胞拷貝數(shù)分析的研究也表明，CNA在單個腫瘤細胞中高度穩(wěn)定。與拷貝數(shù)數(shù)據(jù)相比， scDNA-seq得到的突變數(shù)據(jù)可以支持分支進化研究，因為它表明突變發(fā)生得更為緩慢，并且多個譜系和克隆通常在同一時間點共存于腫瘤中。scDNA-seq數(shù)據(jù)的方法可以用來識別克隆中驅動突變的組合和相互排斥性，為臨床干預提供指導。例如，在兒童急性淋巴細胞白血病中，靶向scDNA-seq鑒定出與增殖有關的晚期癌基因突變，這些突變可以靶向治療該病。在急性髓系白血病（AML）中，微滴scDNA-seq分析發(fā)現(xiàn)了在用FLT3抑制劑治療后出現(xiàn)的NRAS、KRAS和FLT3的同時突變，為治療提供了額外的靶點。通過應用scDNA-seq和scRNA-seq，一項關于慢性淋巴細胞白血?。–LL）的研究發(fā)現(xiàn)了LCP1和WNK1的驅動突變，并表明不同的遺傳譜系可以采用類似的表達程序。另一項CLL研究應用scRRBS-seq和scRNA-seq重建B細胞系，并顯示在ibrutinib治療后，B細胞的特定譜系顯示Toll樣受體通路上調(diào)。腫瘤轉移與CTC測序分析 腫瘤轉移與癌癥患者的發(fā)病率和死亡率高度相關。在轉移方面的知識缺口包括：原發(fā)腫瘤中的哪些克隆能夠傳播，癌細胞向遠處器官部位擴散的次數(shù)，以及TME是否在轉移生態(tài)位中起作用。SCS方法可以解決原發(fā)性和轉移性腫瘤中的ITH和TME，以及關鍵的中間產(chǎn)物CTC，為深入研究這些問題提供了思路。在原發(fā)性結直腸癌和肝轉移瘤中，兩名患者的scDNA-seq發(fā)現(xiàn)了一種向肝臟的晚期傳播的模型。在一例乳腺癌患者衍生的異種移植（PDX）中，scRNA-seq鑒定出在疾病中啟動轉移和MYC表達的干細胞樣細胞。另一項腎細胞癌的PDX研究使用scRNA-seq識別轉移特征，包括EGFR、Scr和BRAF/MEK等提供潛在治療靶點的基因。在人類頭頸癌中，腫瘤細胞的scRNA-seq鑒定了侵襲性表達程序，包括細胞周期、應激、缺氧、分化和部分EMT程序，這些程序促進了轉移。SCS方法也被用于分析腫瘤轉移中CTC的基因組和轉錄組。使用scDNA-seq的研究發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)性和轉移性腫瘤相比，CTC中的突變和CNA高度一致。在人類血液樣本中，CTC和CTC細胞簇的轉錄組的scRNA-seq也識別了與傳播有關的基因。在胰腺癌中，scRNA-seq鑒定出低增殖、富含干細胞基因和基質(zhì)來源的細胞外基質(zhì)基因的轉移特征。在乳腺癌中，CTC的scRNA-seq確認plakoglobin是CTC細胞簇形成中的一個關鍵細胞連接基因，可以提高傳播效率。scRNA-seq鑒定的CTC基因表達特征與肺癌、乳腺癌和前列腺癌的治療反應和轉移風險相關，為臨床應用鋪平了道路。治療性耐藥 耐藥性是人類癌癥治療的主要障礙。雖然化療、激素治療、靶向治療和免疫治療等治療通常最初是有效的，但許多患者對腫瘤轉移產(chǎn)生了抵抗。研究的關鍵領域包括了解耐藥性的機制、識別反應的預測性生物標志物以及闡明耐藥疾病的演變。SCS方法可以從具有臨床結果數(shù)據(jù)的治療前樣本或治療前后收集的縱向時間點樣本來研究ITH和TME。一些研究已經(jīng)應用scRNA-seq來識別組織樣本和CTC的治療反應和耐藥性的特征。在ER+/HER2乳腺癌中，scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)化療期間CTC中HER2信號的差異與耐藥性相關。在前列腺癌中，CTC的scRNA-seq分析確定了雄激素受體抑制劑抵抗中激活的非典型Wnt信號。用藥物處理過的細胞系和用scRNA-seq分析的細胞系也提供了對耐藥性的見解。在內(nèi)分泌抵抗性乳腺癌中，使用scRNA-seq分析的細胞系顯示，KDM5抑制劑耐藥性是由于獲得的表觀遺傳狀態(tài)，在抗雌激素的ER+細胞中高表達KDM5和ITH。在另一項乳腺癌研究中，scRNA-seq在接受化療的細胞系中發(fā)現(xiàn)，用BRAF抑制劑治療的黑色素瘤細胞系中，EMT和干細胞性的基因上調(diào)，細胞周期基因下調(diào)，發(fā)現(xiàn)了一種罕見的預耐藥細胞狀態(tài)，這需要進一步的表觀遺傳重編程和SOX10的失活來達到完全抗性的狀態(tài)。在其他接受化療治療的口腔癌細胞系研究中，scRNA-seq分析表明，表型異質(zhì)性有利于選擇已有的克隆，而同質(zhì)群體通過增加SOX9表達和SOX2缺失導致表觀基因組重編程。為了了解耐藥的基因組演變，一些研究使用scDNA-seq方法來了解耐藥克隆是否預先存在于腫瘤中，并在治療后進行選擇（適應性耐藥），或者是否有治療誘導的耐藥突變（獲得性耐藥）。在一項針對小細胞肺癌（SCLC）患者的CTC的研究中，對化療前后血樣的分析顯示治療后的CNA圖譜一致，表明存在固有或適應性耐藥模型。在另一項關于TNBC輔助化療耐藥的研究中，使用scDNA-seq和scRNA-seq的組合分析顯示，耐藥基因型在腫瘤中預先存在，并進行適應性選擇，然后進一步轉錄重編程以獲得完全耐藥表型。在耐藥前列腺癌中，CTC的scDNA-seq顯示，在耐藥期間，亞克隆中選擇了MYC和AR擴增。在使用FLT3抑制劑治療的AML患者中，scDNA-seq鑒定出在DNMT3A突變或IDH2、AXSL1和NRA結合后出現(xiàn)的罕見亞克隆。抗藥性疾病的TME重編程也可以用scRNA-seq和scATAC-seq方法進行研究。在黑色素瘤中，scRNA-seq在細胞毒性T細胞群中發(fā)現(xiàn)了與治療反應相關的TCF7+記憶樣細胞狀態(tài)。在基底細胞癌中，scATAC-seq用于分析PD-1（程序性細胞死亡蛋白1）阻斷治療前后的活檢，結果表明，治療后衰竭的T細胞高度擴張，這表明PD-1阻斷可影響TME中的CD4+和CD8+細胞狀態(tài)。這些研究強調(diào)了SCS方法在揭示免疫TME在治療反應和耐藥性中的作用的潛力。 3 臨床SCS樣品處理流程 從診所收集和處理SCS的新鮮組織顯示獨特的后勤和技術挑戰(zhàn)。雖然scDNA-seq和scATAC-seq方法可應用于多種生物樣本（快速冷凍組織、最佳切割溫度（OCT）培養(yǎng)基冷凍樣品，甚至福爾馬林固定石蠟包埋FFPE），但scRNA- seq等方法需要預先制備活細胞懸浮液（圖2A）。問題是組織的快速冷凍（不使用冷凍介質(zhì)）會導致細胞膜破裂，因此無法為隨后的分離和運行scRNA-seq分析提供完整的細胞。幸運的是，在凍融循環(huán)中，核膜保持完整，保護了細胞核中的DNA、染色質(zhì)甚至RNA。這種獨特的特性使得研究人員能夠從快速冷凍或OCT組織中分離出核懸浮液進行單核測序，包括snDNA-seq、snATAC-seq和snRNA-seq（圖2A）。然而，盡管該策略對scDNA分析有效，但核RNA的分析會導致基因計數(shù)減少、UMI降低，以及許多基因和通路表達的差異。因此，在大多數(shù)研究和臨床應用中，scRNA-seq方法是首選的方法，它需要實施一個快速組織分離（RTD）的程序，而目前大多數(shù)癌癥醫(yī)院的常規(guī)病理學實驗室還沒有這種方法。為了在短時間內(nèi)為scRNA-seq獲得新鮮的臨床組織，必須建立一個RTD計劃，其中包括腫瘤醫(yī)生、外科醫(yī)生、病理學家和研究人員之間的密切合作（圖2B）。在RTD計劃中，外科醫(yī)生必須在一個快速的時間范圍內(nèi)將切除的腫瘤組織交給病理學家，然后病理學家必須確定高純度的腫瘤區(qū)域進行宏觀解剖（手術標本），并將組織放入細胞培養(yǎng)基中，理想情況下，在不到1小時的時間內(nèi)。對于核心活檢或細針抽吸（FNA）樣本中，這一時間可以大大減少，因為放射科醫(yī)生可以將樣本直接放入培養(yǎng)基管中，并為病理學家提供不同的樣。一旦組織浸沒在培養(yǎng)基中，研究小組就可以將樣本轉移回實驗室進行分離，產(chǎn)生單細胞懸浮液。理想情況下，癌癥醫(yī)院會建立一個專門的RTD設施，集中處理來自手術或活檢程序的組織樣本，以產(chǎn)生活細胞懸浮液。然而，RTD面臨的一個挑戰(zhàn)是，每種組織類型（如乳腺、胰腺、肝臟）都需要不同的解離方案，解離時間、消化酶、紅細胞裂解和其他步驟可能不同。幸運的是，諸如人類細胞圖譜（HCA）等合作努力正在為許多組織類型開發(fā)標準步驟，這些組織類型可在網(wǎng)上獲取(www.protocols.io)并幫助研究人員。細胞分離后，必須對細胞活力（理想情況下>70%）和細胞計數(shù)（理想情況下>100K細胞總數(shù)）進行質(zhì)量控制。幸運的是，在這一步之后，活細胞可以在冷凍介質(zhì)中長時間冷凍保存，并分批進行許多scRNA-seq實驗。然而，在邏輯上可行的情況下，從新鮮細胞懸浮液中提取樣本而不進行冷凍保存會產(chǎn)生最佳的數(shù)據(jù)質(zhì)量。另一個可選步驟涉及使用流式細胞儀或抗體柱富集感興趣細胞（例如CD45）、基質(zhì)細胞或腫瘤細胞（例如Ep-CAM、細胞角蛋白）。最后的細胞懸液作為SCS方法的研究樣本，然后進行二代測序（NGS）。盡管FFPE擁有豐富的臨床組織來源信息和長期臨床結果信息，但這些材料與標準SCS方法不兼容。主要問題是，當組織置于福爾馬林中時，F(xiàn)FPE處理會導致RNA和DNA的斷裂和降解。雖然scRNA和scATAC方法在FFPE材料中可能永遠不可能，但scDNA-seq方法的發(fā)展可能使CNA分析和靶向突變分析在不久的將來成為可能。通過在癌前乳腺癌組織的FFPE組織中添加DNA損傷修復酶進行單細胞CNA分析，初步取得了成功。其他設計用于PCR擴增靶區(qū)的策略可能也適用于DNA斷裂的FFPE組織。因此，未來scDNA-seq技術的發(fā)展可能會為臨床病理學中常用的FFPE組織和蘇木精-伊紅玻片打開大門。
圖2 SCS臨床組織相容性與處理流程 4 在癌癥醫(yī)學中的應用 盡管迄今為止發(fā)表的大多數(shù)SCS研究都是以研究為中心，但SCS技術的發(fā)展和完善為臨床翻譯提供了新的機會。希望SCS將改變癌癥醫(yī)學的幾個領域，包括早期檢測、診斷和風險分層、藥物靶向發(fā)現(xiàn)、靶向微環(huán)境、靶向腫瘤克隆和無創(chuàng)監(jiān)測（圖3A）。這里將討論這些領域的初步進展以及未來臨床意義上的挑戰(zhàn)。早期檢測 早期檢測在現(xiàn)代腫瘤學中是最重要的，因為它可以干預和降低患者的發(fā)病率。然而，早期癌癥的發(fā)現(xiàn)仍然嚴重依賴于影像學技術和病理學分析。擴散性腫瘤細胞可通過細胞病理學在許多接近癌源的體液中檢測到，例如膀胱癌和前列腺癌的尿液；子宮內(nèi)膜癌和胰腺癌的卵巢腹膜沖洗液；鼻咽癌的唾液。這些樣本為SCS方法評估進展風險提供了一個獨特的機會。早期發(fā)現(xiàn)對于癌癥發(fā)展的高危人群尤其重要，包括腫瘤抑制基因突變（如BRCA1和BRCA2突變）、胃酸反流、炎癥性腸病和有大量吸煙史的患者。盡管迄今為止，大多數(shù)研究都集中在使用影像學方法或病理染色來識別體液中的早期癌細胞，但SCS方法可以提供更豐富的信息，說明這些細胞有可能對患者造成進展。在最初的一項研究中，scRNA-seq被用于研究40名多發(fā)性骨髓瘤患者和11名健康對照，確定了一些無癥狀疾病患者的罕見侵襲性漿細胞的表達程序。期望未來應用scDNA-seq和scRNA-seq結合早期篩查和診斷，將有助于提高早期檢測和評估進展為惡性疾病的風險。改進臨床診斷和風險分層 侵襲性癌癥的臨床診斷很大程度上依賴于組織病理學評估，而這些評估往往存在差異。SCS方法已被證明在DCIS、胰腺癌前病變、前列腺導管內(nèi)瘤樣病變和非典型腺瘤性增生中的癌前細胞進行分析非常有效。在浸潤性前列腺癌中，通過組織活檢單細胞分析檢測到的侵襲性克隆群體與手術Gleason評分有很好的相關性，從而指導基于病理診斷的手術決策。在另一項研究中，SCS的結直腸癌亞型被用于確定個體患者的最佳治療方案。另一個臨床機會涉及未知原發(fā)性癌癥的診斷，它代表一種沒有明確器官來源的侵襲性癌癥，其中scRNA-seq和scATAC-seq方法可以提供對初始器官部位的洞察，從而對治療有意義。風險分層是癌癥治療過程中個性化治療計劃的另一個重要方面，包括（1）診斷時，（2）局部治療完成后，（3）轉移復發(fā)時。目前的風險分層工具依賴于組織病理學分析、細胞遺傳學標記、種系突變或基因表達組合。然而，使用普通RNA-seq分析和qPCR的預測基因表達組合受到腫瘤、間質(zhì)和免疫細胞混合物的挑戰(zhàn)，這些細胞因患者而異。目前的基因表達組合并不是針對單個患者的精確預測，而是提供基于人群的預測（例如，相同得分的患者組的復發(fā)率）。通過scRNA-seq方法從腫瘤細胞或TME中獲得純細胞類型特異性表達信號，從而預測進展、轉移或治療耐藥的風險，這些檢測方法可能會得到改進。因此，SCS方法有可能改進診斷和風險評估，以確定哪些患者需要更積極的治療策略。藥物靶點發(fā)現(xiàn) SCS方法發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞和原發(fā)性、轉移性或抗治療性疾病的TME提供了有力的工具。例如，在前列腺癌中，CTC的scRNA-seq分析確定了雄激素受體抑制劑耐藥性中激活的非經(jīng)典Wnt信號，為治療晚期疾病提供了新的治療靶點。在乳腺癌中，scRNA-seq鑒定出NOTCH1和HER2在患者來源的CTC中的表達呈負相關，其中HER2陰性CTC對docetaxel的敏感性降低，但對可能用于治療的Notch抑制劑敏感。在一項臨床前研究中，docetaxel敏感和耐藥的MCF7乳腺癌細胞株的scRNA-seq鑒定了耐藥細胞中上調(diào)的EMT和干細胞性的相關基因以及下調(diào)的細胞周期基因，為克服耐藥性提供了潛在的藥物靶點?？v向抽樣腫瘤治療也可以確定耐藥克隆的出現(xiàn)和潛在的藥物靶點。在耐化療的TNBC患者中，縱向活檢的snRNA-seq識別了EMT、AKT1信號、缺氧、CDH1和血管生成的特征，這些特征可能是治療耐藥疾病的目標。scRNA-seq和scATAC-seq的方法可用于研究TME中的細胞類型，并識別基質(zhì)中的藥物靶點和促進進展、轉移或治療性耐藥的免疫細胞類型。在用抗HER2和CDK4/6抑制劑治療的乳腺癌小鼠模型中，scRNA-seq鑒定了對cabozantinib敏感的Gr1+未成熟髓系細胞的富集，提供了一個新的治療靶點，并在人類患者中得到驗證。在另一項乳腺癌研究中，scRNA-seq揭示了接受內(nèi)分泌治療的患者通過轉錄組重編程和拷貝數(shù)變化而產(chǎn)生的一系列適應性變化。因此，希望SCS方法能為TME和腫瘤細胞提供新的藥物靶點，從而提高腫瘤患者的治療水平，從而開創(chuàng)藥物開發(fā)的新紀元。靶向腫瘤微環(huán)境 TME中重編程的細胞類型，包括CAF、TEC、TAM和腫瘤脂肪細胞，對腫瘤進展、轉移或治療抵抗有顯著影響。在研究背景下，scRNA-seq或scATAC-seq方法是研究TME和識別腫瘤中可促進或抑制腫瘤生長或治療抵抗的重組免疫和基質(zhì)細胞類型的有力工具。這些數(shù)據(jù)原則上可用于在臨床環(huán)境中對異常細胞類型選擇靶向治療（圖3B）。例如，含有TAM的腫瘤可以用ANG2/TIE2軸抑制劑（rebastinib）、MIF抑制劑（抗CD74抗體）或他汀類藥物來間接調(diào)節(jié)TAM的功能（辛伐他汀、阿托伐他汀）。重組樹突狀細胞的腫瘤可以用腺苷A2A和A2B受體雙重抑制劑（AB-928）或抗CD73（BMS-986179）治療。T細胞可以用檢查點抑制劑治療：抗CTLA（ipilimumab）、抗PD1（pembrolizumab、durvalumab）和抗PD配體1（atezolizumab、avelumab）。類似地，具有重組基質(zhì)細胞類型的腫瘤，如TEC，可以用JAK-STAT（ruxolitinib）和血管內(nèi)皮生長因子（bevacizumab、cabozantinib）抑制劑治療。CAF可以用FAP抑制劑（PT-100、sibrotuzumab）或核受體調(diào)節(jié)劑（MORAb2、WYC-209）治療。這些SCS工具可以大大提高針對TME中重編程細胞類型的能力，以提高癌癥治療的療效。靶向腫瘤細胞 ITH在實體腫瘤中很常見，因此通過普通測序檢測到的單個基因靶點可能對腫瘤中的所有克隆都無效。ITH可以用scDNA-seq進行解析，以重建克隆譜系并識別腫瘤譜系中的主干型（在所有腫瘤細胞中）、亞克隆型（在譜系中共享）或私有型（只有一個克?。┑耐蛔?。重要的是，scDNA-seq可以揭示腫瘤組織中克隆突變的組合，以識別某些突變在同一腫瘤細胞中是相互排斥的還是同時發(fā)生的。腫瘤學家可以利用這些數(shù)據(jù)來指導治療決策，靶向突變是主干型的或是亞群的，這些突變可能具有更高的轉移、治療抵抗或進展的風險（圖3A）。在急性髓系白血病中，使用微滴系統(tǒng)的高通量scDNA-seq識別了治療背景下的克隆重構，以確定用于治療復發(fā)性疾病的相關病理克隆。腫瘤細胞的scRNA-seq等方法也可以通過提供腫瘤細胞及其信號通路的表型信息來研究EMT、增殖、遷移和凋亡等過程中的異質(zhì)性，從而在指導治療過程發(fā)揮作用。因此，SCS方法為解決腫瘤中的克隆亞結構和指導基于突變共現(xiàn)和異常表達程序的治療決策提供了強有力的工具。無創(chuàng)監(jiān)測 迄今為止，SCS方法的最廣泛應用是在CTC的基因組分析中，對疾病進展進行無創(chuàng)監(jiān)測，檢測耐藥克隆的出現(xiàn)，并跟蹤最小疾病殘留。與轉移性組織活檢相比，CTC分析全面監(jiān)測跨多器官部位的基因組畸變和微轉移。此外，這些方法允許縱向測量跟蹤腫瘤細胞在疾病進展和治療過程中的基因組變化，而無需進行侵入性活檢。與循環(huán)腫瘤DNA方法相比，CTC還可以解決血液中的克隆多樣性，并提供RNA基因表達的信息。在前列腺癌中，使用scDNA-seq分析CTC隨時間的變化有助于檢測CTC的克隆和亞克隆變化，這些變化提供了進展、回歸和耐藥疾病出現(xiàn)的信息。單時間點樣本的CTC也可用于預測治療反應和臨床結果。在一項乳腺癌研究中，CTC的scRNA-seq識別出17個以上的乳腺癌特異性RNA特征，這些特征用于生成評分，以預測臨床結果和進展風險。同樣，在前列腺癌中，使用與較差整體生存率和早期傳播相關的基因特征，確定了轉移和局部部位的兩個CTC評分。因此，使用SCS方法對CTC進行無創(chuàng)監(jiān)測和風險預測具有很大的潛力。
圖3 單細胞基因組學的臨床應用 最后，SCS技術已經(jīng)改變了癌癥研究的許多領域，并準備在臨床上產(chǎn)生更大的影響。正如NGS技術在過去十年里改變了現(xiàn)代腫瘤學一樣，預計SCS方法將影響癌癥醫(yī)學的許多領域，并將成為癌癥醫(yī)院的常用工具。雖然在醫(yī)院廣泛開展SCS研究的最大障礙可能是RTD項目的實施，但從SCS分析中獲得的豐富信息可以證明這些努力的合理性。未來幾年，包括空間SCS和多組學方法在內(nèi)的新興技術將進一步擴展SCS方法的能力，并將對癌癥研究和臨床病理學產(chǎn)生重大影響。總的來說，預計在未來十年，SCS在癌癥醫(yī)學中的應用將導致癌癥患者診斷和治療的巨大改善。
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