編譯：Tigobin，編輯：十九、江舜堯。

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研究者使用外顯子捕獲RNA測(cè)序方案來(lái)檢測(cè)和表征超過(guò)2000個(gè)癌癥樣本中的CircRNAs。與Ribo-Zero和RNase R相比，捕獲測(cè)序顯著增強(qiáng)了CircRNA的富集，并保留了準(zhǔn)確的環(huán)線比。利用捕獲測(cè)序，研究者建立了迄今為止最全面的CircRNA物種目錄：MiOncoCirc，這是第一個(gè)主要由直接在腫瘤組織中檢測(cè)到的CircRNA組成的數(shù)據(jù)庫(kù)。使用MiOncoCirc，研究者確定了候選CircRNA作為前列腺癌的生物標(biāo)志物，并能夠檢測(cè)到尿中的CircRNA。研究者進(jìn)一步檢測(cè)到一類新的循環(huán)轉(zhuǎn)錄本，稱為通讀CircRNAs，它涉及來(lái)自不同基因的外顯子。

1. 外顯子組捕獲RNA-Seq是一種分析CircRNA的有效方法。

研究者驗(yàn)證了外顯子捕獲RNA-Seq與Ribo-Zero測(cè)序的性能，Ribo-Zero測(cè)序是檢測(cè)CircRNA最常用的高通量方法。與RiboZero相比，捕獲測(cè)序在一組細(xì)胞系和冰凍組織中持續(xù)檢測(cè)到每個(gè)文庫(kù)中更多的CircRNA物種(圖1A)。此外，使用VCaP前列腺癌細(xì)胞，研究者驗(yàn)證了Ribo-Zero文庫(kù)中存在的大多數(shù)CircRNA物種也存在于該細(xì)胞系的匹配捕獲文庫(kù)中(圖1B)。與在Ribo-Zero中一樣，捕獲時(shí)保留了環(huán)形到線性的部分(圖1C)。此外，在RNaseR后處理中，捕獲測(cè)序產(chǎn)生了所有CircRNA物種的總體環(huán)線比升高(圖1D)，從而證實(shí)研究者的捕獲測(cè)序方法檢測(cè)到了真正的環(huán)狀分子，而不是該方案固有的潛在連接偽像。

圖1.外顯子捕獲RNA-SEQ方法檢測(cè)CircRNA的有效性。(A)與匹配的Ribo-Zero樣本相比，捕獲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在來(lái)自臨床樣本和細(xì)胞系的六對(duì)文庫(kù)中始終檢測(cè)到更多的環(huán)狀RNA(CircRNA)。(B)在VCaP細(xì)胞系文庫(kù)中，外顯子捕獲平臺(tái)和Ribo-Zero測(cè)序平臺(tái)上檢測(cè)到的CircRNA物種有顯著重疊。(C)在VCaP中，捕獲測(cè)序保留了CircRNA相對(duì)于其線性對(duì)應(yīng)物的相對(duì)豐度，與Ribo-Zero文庫(kù)相當(dāng)(Spearman秩相關(guān)r=0.65)(見STAR方法)。(D)從MiOncoCirc渠道中調(diào)用的反向剪接事件在RNase R處理后在VCaP和22Rv1細(xì)胞系中升高，進(jìn)一步證實(shí)它們是真實(shí)的CircRNA，而不是連接人工產(chǎn)物。

2. 用外顯子捕抓RNA-Seq構(gòu)建MiOncoCirc綱要。

此處報(bào)道的MiOncoCirc版本包括868個(gè)樣品，這些樣品是從先前發(fā)布的臨床樣品和癌細(xì)胞系以及合并的正常組織的數(shù)據(jù)集中獲得的（圖2A）。圖2B和STAR方法中詳細(xì)介紹了用于創(chuàng)建MiOncoCirc的方案和生物信息學(xué)渠道。有關(guān)CircRNAs和RT-CircRNAs的信息可以在MiOncoCirc網(wǎng)站上找到，該網(wǎng)站還可以查詢和下載不同癌癥類型的CircRNA豐度及其親本基因的表達(dá)(圖2C；STAR方法)。

圖2. MiOncoCirc綱要的構(gòu)建和概述。（A）包括來(lái)自先前發(fā)布的數(shù)據(jù)集以及細(xì)胞系面板和正常組織的868個(gè)高深度，雙末端RNA-seq樣本。（B）外顯子組捕獲RNA-seq方案和用于創(chuàng)建MiOncoCirc的生物信息學(xué)渠道。（C）MiOncoCirc是一個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)，可以查詢和下載不同組織中circRNA的豐度。

3. 微小腫瘤循環(huán)中CircRNAs的特征。

除了CircBase提供的物種之外，MiOncoCirc還發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)數(shù)量的CircRNA物種，CircBase是不同來(lái)源的CircRNA綱要。為了分析重疊，研究者首先使用了一個(gè)嚴(yán)格的截止點(diǎn)，它只包括來(lái)自數(shù)據(jù)集的至少五個(gè)不同樣本中出現(xiàn)的CircRNA。使用這一標(biāo)準(zhǔn)，MiOncoCirc和CircBase在循環(huán)轉(zhuǎn)錄本(圖3A)和親本基因方面顯著重疊。通過(guò)進(jìn)一步研究MiOncoCirc中的CircRNA物種，研究者發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生CircRNA的基因傾向于形成多個(gè)環(huán)狀異構(gòu)體。環(huán)狀異構(gòu)體的數(shù)量與每個(gè)基因的外顯子數(shù)量成比例增加(圖3B)。研究者進(jìn)一步確定，親本基因的平均豐度與其相關(guān)的CircRNA的平均豐度只有微弱的相關(guān)性(圖3C)。此外，在所有868個(gè)樣本中以及兩個(gè)樣本組（前列腺癌和乳腺癌）中，circRNA及其親本表達(dá)的Spearman等級(jí)相關(guān)性都很低（圖3D）。研究者還在MiOncoCirc中發(fā)現(xiàn)了CircRNAs的一個(gè)子集，它可以在90%的樣本中持續(xù)檢測(cè)到，并且豐度高于所有CircRNAs的中位數(shù)（圖3E）。從這一基因子集產(chǎn)生的CircRNA的特征是側(cè)翼內(nèi)含子明顯更長(zhǎng)(圖3F)，這些內(nèi)含子比豐度較低的CircRNA側(cè)翼的內(nèi)含子含有更多的重復(fù)元件。長(zhǎng)的側(cè)翼內(nèi)含子可能含有更多的促進(jìn)循環(huán)的重復(fù)和反向互補(bǔ)元件，被發(fā)現(xiàn)是環(huán)狀RNA生物發(fā)生的標(biāo)志。事實(shí)上，即使是在研究者的綱要中豐度“低”的那類CircRNA也比全基因組范圍內(nèi)的所有內(nèi)含子表現(xiàn)出明顯更長(zhǎng)的側(cè)翼內(nèi)含子和更多的重復(fù)元件(圖3F)。

圖3. MiOncoCirc中circRNA的特征以及與表達(dá)相關(guān)的特性。（A）MiOncoCirc和CircBase中circRNA種類的重疊很明顯。此比較僅包括出現(xiàn)在五個(gè)或更多樣本中的高置信度circRNA。（B）基因可以形成多個(gè)circRNA轉(zhuǎn)錄物。環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量與每個(gè)基因的外顯子數(shù)量成比例地增加。circRNA豐度的平均表達(dá)與親本表達(dá)的平均表達(dá)（在FPKM中）。（C）親本基因表達(dá)分為50個(gè)步長(zhǎng)區(qū)?？傮w而言，步長(zhǎng)區(qū)均值沒有差異。（D）在所有樣本(灰色)、前列腺癌(PRAD，藍(lán)色)和乳腺癌(BRCA，紅色)中，CircRNA豐度與其同源親本基因表達(dá)之間的Spearman等級(jí)相關(guān)分布?？傮w而言，相關(guān)性很低(所有中位數(shù)均<0.28)。(E)環(huán)狀RNA豐度與樣品成分的關(guān)系(%)。在超過(guò)90%的樣本中檢測(cè)到一小部分CircRNA(由589個(gè)基因產(chǎn)生的CircRNAs<2%，標(biāo)記為“高”)。(F)與其余98%的CircRNA相比，這些“高”的CircRNA兩側(cè)的內(nèi)含子要長(zhǎng)得多。包括全基因組內(nèi)含子作為對(duì)照。

4. rt-circRNA的流行及其特征。

如果沒有通過(guò)綜合臨床測(cè)序方法獲得的匹配的全基因組測(cè)序(WGS)和全外顯子組測(cè)序(WES)的基因組信息，rt-CircRNAs看起來(lái)會(huì)類似于RNA-seq中串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生的線性轉(zhuǎn)錄本(圖4A和4B)。rt-CircRNAs還展示了典型CircRNAs的基因組商標(biāo)，因?yàn)樗鼈兊膬蓚?cè)有更長(zhǎng)的內(nèi)含子(圖4C)和含有更多重復(fù)元件(圖4D)。這些涉及兩個(gè)基因的反向剪接讀物中的一些通常在不同的癌癥類型中發(fā)現(xiàn)（圖4E），甚至在正常組織中或在具有正?？截悢?shù)（二倍體）親本基因的樣品中檢測(cè)到，這進(jìn)一步表明它們是真正的常見轉(zhuǎn)錄組而不是罕見的基因組事件。為了通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR（qRT-PCR）進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證此類通讀轉(zhuǎn)錄本已被環(huán)化，研究者搜索了在細(xì)胞系中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，并選擇了跨越兩個(gè)相鄰基因TTTY15和USP9Y的反向剪接事件，在Y染色體上相距不到9kb，并且在幾個(gè)前列腺癌組織樣本中被檢測(cè)到（圖4F）。通過(guò)qRT-PCR在LNCaP前列腺癌細(xì)胞中檢測(cè)到涉及TTTY15外顯子3的向外引物和USP9Y外顯子3的產(chǎn)物，以及涉及同一對(duì)外顯子的向內(nèi)引物的產(chǎn)物（請(qǐng)參見STAR方法）。但是，只有向外擴(kuò)增的產(chǎn)物才對(duì)RNase R降解具有抗性（圖4F），并且USP9Y和TTTY15的反向剪接外顯子-外顯子連接已通過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，從而確認(rèn)靶標(biāo)是環(huán)狀分子。

圖4.鑒定新型rt-circRNA物種。（A）示意圖顯示，涉及兩個(gè)基因的基因組串聯(lián)重復(fù)和circRNA在配對(duì)末端RNA-seq中可能看起來(lái)相似。（B）示意圖描繪了可以從兩個(gè)相鄰基因及其基因組特征產(chǎn)生的循環(huán)通讀事件。(C)rt-CircRNA側(cè)翼的內(nèi)含子比全基因組內(nèi)含子長(zhǎng)。（D） rt-circRNAs側(cè)翼的內(nèi)含子比全基因組的內(nèi)含子含有更多的重復(fù)成分。(E)在研究者的綱要中，前30個(gè)最豐富的反向剪接事件涉及鄰近基因的頻率和分布。(F)選擇涉及TTTY15的外顯子3和USP9Y的外顯子3的循環(huán)通讀事件在LNCaP細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。在RNaseR處理后，只有外向引物的qRT-PCR產(chǎn)物對(duì)外切核糖核酸酶降解具有抗性(見STAR方法)。

5. circRNA在癌癥中的特性。

基于這些分析，研究者確定在綱要中CircRNA的基因可以分為三類：組織特異性(n=895)，非組織特異性(n=2，329)和普遍存在(n=1，469)(圖5A)。為了表征CircRNAs在腫瘤和正常細(xì)胞之間的表達(dá)模式是否有所不同，研究者對(duì)25對(duì)匹配的腫瘤和局限性原發(fā)性前列腺癌(PRAD)正常細(xì)胞的CircRNAs進(jìn)行了差異豐度分析(圖5B)。在顯示癌癥與正常相比豐度不同(n=652)的循環(huán)轉(zhuǎn)錄本中，大多數(shù)(n=629)在癌癥中表達(dá)下調(diào)(圖5C)。雖然一些CircRNA的下調(diào)可以解釋為親本基因的下調(diào)(圖5C)，但在前列腺癌中也有豐度相對(duì)較低的CircRNA，而親本基因的表達(dá)沒有明顯的變化(圖5C)。在研究者的25對(duì)配對(duì)的正常人和PRAD中，CircRNA總豐度與MKI67和PCNA的表達(dá)以及一組細(xì)胞周期進(jìn)展基因(如MCM10、TOP2A、KIAA0101和NUSAP1)呈一致的負(fù)相關(guān)，這些基因的mRNA水平已被用作前列腺癌的增殖標(biāo)志物(圖5D)。神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌(NEPC)是一種罕見的侵襲性前列腺癌亞型，可由PRAD的激素后治療引起，預(yù)后不良。研究者的8例NEPC病例均以神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物(如SYP、CHGA、CHGB、NCAM1、ENO2、ASCL1、MYCN和AURKA)上調(diào)和AR信號(hào)通路基因(如AR、AMACR、KLK3、KLK2、FKBP5和PSCA)下調(diào)為特征(圖6A)。然后，研究者進(jìn)行了CircRNA差異表達(dá)分析(圖6B)，發(fā)現(xiàn)了34個(gè)上調(diào)和48個(gè)下調(diào)的CircRNA，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。在NEPC中，最顯著的上調(diào)和下調(diào)的CircRNAs分別是CIRC-AURKA和CircAMACR(圖6C)。這一發(fā)現(xiàn)與AURKA和AMACR親本基因表達(dá)的變化一致(圖6A)。研究者在RNase R處理的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞系NCI-H660中進(jìn)行了qRT-PCR，證實(shí)CIRC-AURKA是從外顯子6反剪接到外顯子3產(chǎn)生的(圖6D)。最后，研究者證實(shí)CIRC-AURKA在NEPC細(xì)胞系NCI-H660中的表達(dá)高于在非NEPC前列腺細(xì)胞系LNCaP和VCaP中的表達(dá)，這一結(jié)果與其親本基因的表達(dá)一致(圖6E)。

圖5.CircRNAs在癌癥中的表達(dá)模式和特征。(A)可以產(chǎn)生CircRNA的基因的組織特異性熱圖，如MiOncoCirc綱要中的17個(gè)癌癥隊(duì)列所示。如果一個(gè)基因在任何給定譜系的超過(guò)30%的樣本中產(chǎn)生了至少一個(gè)高置信度CircRNA，那么它就被認(rèn)為是一致檢測(cè)到的(參見STAR方法)。(B)25對(duì)匹配的正常前列腺癌和局限性前列腺癌CircRNA豐度的火山圖。(C)CircRNA的對(duì)數(shù)折疊變化(Fc)與線性表達(dá)的對(duì)數(shù)Fc的相關(guān)性。再一次，CircRNA豐度總體上被下調(diào)。根據(jù)線性折疊變化和環(huán)形折疊變化之間的關(guān)系，研究者進(jìn)一步將基因分組。第一組(紅色)是在癌癥中上調(diào)的CircRNA，因?yàn)樗鼈兊挠H本基因上調(diào)了。第2組(紫色)是那些在癌癥中表達(dá)下調(diào)的CircRNA，因?yàn)樗鼈兊挠H本基因也下調(diào)了。然而，在癌癥中有一組CircRNAs(第3組，藍(lán)色)表達(dá)下調(diào)，而父母基因的表達(dá)沒有相應(yīng)的變化。(D)總CircRNA與FPKM計(jì)算的前列腺癌mRNA增殖標(biāo)志物相關(guān)(MCM10、TOP2A、MKI67、PCNA、KIAA0101和NUSAP1)。點(diǎn)的大小和色標(biāo)表示成對(duì)Spearman等級(jí)相關(guān)的值。

圖6.前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌中差異的CircRNAs。(A)與去勢(shì)抗性前列腺癌(CRPC)病例相比，研究者隊(duì)列中的NEPC病例(根據(jù)病理評(píng)估的細(xì)胞形態(tài)學(xué)分類)均以神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物(SYP、CHGA、CHGB、NCAM1、ENO2、ASCL1、MYCN和AURKA)上調(diào)和AR信號(hào)通路基因(AR、AMACR、KLK3、KLK2、FKBP5和PSCA)下調(diào)為特征。(B)NEPC組34例上調(diào)、48例下調(diào)的CircRNA熱圖與CRPC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(C)NEPC與CRPC相比，CircRNA上調(diào)最顯著的是CIRC-AURKA，下調(diào)最顯著的是Circ-AMACR。(D)RNaseR處理的NEPC細(xì)胞株NCI-H660中AURKA的外向引物(從外顯子6到外顯子3反向剪接)的qRT-PCR證實(shí)了該分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。(E)前列腺癌細(xì)胞系中環(huán)狀和線狀AURKA的qRT-PCR。

6.前列腺癌細(xì)胞CircRNA的穩(wěn)定性及前列腺癌患者尿液中CircRNA的檢測(cè)。

所有測(cè)試的CircRNA物種都表現(xiàn)出對(duì)外切核糖核酸酶的抗性，因此明顯比它們的線性對(duì)應(yīng)物種更穩(wěn)定(圖7A)。在放線菌素D處理后0、2、4、8和24小時(shí)收獲的LNCaP細(xì)胞中，CircRNA水平升高，而mRNA水平下降(圖7B)，表明環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物具有相對(duì)較高的穩(wěn)定性。為了確定CircRNA在生物樣品中是否比它們的同源線性RNA更穩(wěn)定，研究者分析了人血漿中CircRNA的穩(wěn)定性。VCaP RNAs在血漿中孵育，以模擬循環(huán)RNA的環(huán)境。事實(shí)上，根據(jù)選定候選者的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本與線性轉(zhuǎn)錄本的比率進(jìn)行評(píng)估，CircRNA在孵育后在血漿中比線性RNA更穩(wěn)定(圖7C)。此外，研究者建立了三個(gè)帶有外顯子捕獲RNA-seq的文庫(kù)，并在前列腺癌患者的尿樣中檢測(cè)到1092個(gè)CircRNAs，它們與MiOncoCirc匯編中PRAD組織樣本中鑒定的CircRNAs完全重疊(圖7D)。

圖7. circRNA比同源線性轉(zhuǎn)錄本更穩(wěn)定，可以在前列腺癌患者的尿液樣本中檢測(cè)到。（A）與線性對(duì)應(yīng)物相比，circRNAs對(duì)RNase R降解具有抗性。（B）在LNCaP細(xì)胞中，放線菌素D抑制轉(zhuǎn)錄后，線性轉(zhuǎn)錄本比相應(yīng)的環(huán)形轉(zhuǎn)錄本降解更快。(C)在血漿中孵育VCaP RNAs后，CircRNAs的環(huán)線比隨時(shí)間增加。(D)用外顯子組捕獲RNA-seq法檢測(cè)3例前列腺癌患者尿液中的CircRNAs。這些CircRNAs與從MiOncoCirc隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)的前列腺癌組織中發(fā)現(xiàn)的CircRNAs有很大重疊。

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