原名：Defining the emergence of myeloid-derived suppressor cells in breast cancer using single-cell transcriptomics

譯名：使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定乳腺癌中髓樣抑制細(xì)胞的出現(xiàn)

期刊：Science Immunology

IF：10.551

發(fā)表時(shí)間：2020年2月21日

通訊作者：Kai Kessenbrock

通訊作者單位：美國(guó)加州大學(xué)歐文分校生物化學(xué)系

DOI號(hào)：10.1126/sciimmunol.aay6017

脾臟是荷瘤小鼠骨髓衍生抑制細(xì)胞（MDSCs）積累的主要部位

通過(guò)小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)多瘤病毒中間T癌蛋白（PyMT）的小鼠形成與人類(lèi)發(fā)病機(jī)理極為相似的乳腺腫瘤，并在腫瘤形成期間產(chǎn)生MDSCs。本研究使用患有乳腺癌的MMTV- PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠模型來(lái)探索MDSCs在乳腺癌進(jìn)展中的作用。研究者首先尋找MDSCs積累的確切器官位置，從而對(duì)該細(xì)胞群進(jìn)行深入的分子研究。與先前在其它小鼠癌癥模型中的報(bào)道一致，研究者觀(guān)察到癌癥進(jìn)展的后期與骨髓、血液、脾臟、肺、大腦和原發(fā)性腫瘤中CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞的擴(kuò)增有關(guān)，并且與野生型（WT）相比，荷瘤PyMT小鼠的脾臟增大。為了在功能上確認(rèn)MDSCs是否存在于荷瘤小鼠CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞的擴(kuò)增種群中，研究者通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS）從荷瘤小鼠和對(duì)照小鼠的各個(gè)器官中分離出CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞，并與分離的T細(xì)胞共培養(yǎng)，從而檢測(cè)CD3/CD28共同刺激引起的T細(xì)胞增殖的抑制作用，而活性氧（ROS）的形成作為一個(gè)MDSC功能的指示數(shù)據(jù)。研究者發(fā)現(xiàn)從荷瘤小鼠脾臟中分選出的CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞顯著抑制CD4⁺和CD8⁺細(xì)胞的增殖，而來(lái)自對(duì)照組小鼠脾臟的CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖并沒(méi)有可檢測(cè)到的影響。從荷瘤小鼠骨髓和肺部分選出的CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞被證實(shí)對(duì)T細(xì)胞增殖沒(méi)有顯著抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)被進(jìn)一步證實(shí)了，即通過(guò)使用2’,7’-二氯熒光素乙酰乙酸鹽（H₂DCFDA）的流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)ROS的產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)只有來(lái)自荷瘤小鼠脾臟的CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的氧化迸發(fā)形態(tài)，并作為MDSCs的標(biāo)志?？傊@些結(jié)果證實(shí)了在PyMT小鼠乳腺腫瘤形成過(guò)程中，脾臟是MDSC出現(xiàn)的主要部位之一。

為了確定MDSCs在細(xì)胞和分子水平上與正常髓樣對(duì)應(yīng)物之間的差異，研究者使用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNAseq）比較了荷瘤小鼠中脾臟來(lái)源的骨髓細(xì)胞與野生型小鼠中各自對(duì)應(yīng)細(xì)胞群體的分子差異。研究者使用可擴(kuò)展的液滴介導(dǎo)的scRNAseq平臺(tái)（10×Genomics Chromium）分析來(lái)自荷瘤PyMT小鼠和對(duì)照組WT小鼠脾臟中經(jīng)FACS純化的（SYTOX-陰性）CD11b⁺Gr1⁺骨髓活細(xì)胞（圖1A）。研究者分別分析了來(lái)自荷瘤PyMT小鼠（9155個(gè)細(xì)胞）和WT小鼠（5491個(gè)細(xì)胞）的兩個(gè)樣品，共計(jì)14,646個(gè)細(xì)胞，且每個(gè)細(xì)胞測(cè)序的平均深度約為50,000個(gè)讀數(shù)。使用Cell Ranger pipeline（10×Genomics）將兩個(gè)庫(kù)匯總并排列在一起，從而補(bǔ)償庫(kù)復(fù)雜性的微小差異。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制過(guò)濾從而去除包含較低檢測(cè)率的基因（＜500個(gè)基因）和較高含量的線(xiàn)粒體基因（＞8%）的細(xì)胞后，研究者使用Seurat對(duì)組合的PyMT和WT數(shù)據(jù)集進(jìn)行了聚類(lèi)分析和細(xì)胞類(lèi)型鑒定分析。通過(guò)典型相關(guān)分析（CCA）方法，研究者基于骨髓亞群標(biāo)志基因的表達(dá)情況鑒定了主要的細(xì)胞類(lèi)型（圖1B），并確定了它們的標(biāo)志性基因。中性粒細(xì)胞形成了最大的細(xì)胞群，涵蓋了許多不同的簇（C0,C2,C4,C5,C7和C8），這些簇的特征是高水平的Ly6g和Cxcr2表達(dá)（圖1，B和C）。單核細(xì)胞的數(shù)量較少，且多樣性較低，只形成了一個(gè)以Csf1r和Ccr2的表達(dá)為標(biāo)志的簇（C1）（圖1，B和C）。研究者還檢測(cè)了兩種次要細(xì)胞類(lèi)型：表達(dá)Cd3、Cd4和Cd8的T細(xì)胞（C9）和表達(dá)Cd19、Cd22和Cd79a的B細(xì)胞（C6,C3）（圖1，B和C）。

對(duì)中性粒細(xì)胞異質(zhì)性的進(jìn)一步調(diào)查顯示，C0簇的特征是與成熟中性粒細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的基因（比如Camp）水平較高，以及Ly6g的高水平表達(dá)；C2簇在荷瘤PyMT小鼠中高度富集，并顯示出高水平的MDSC-相關(guān)基因，比如Arg2 和Il1β，其在先前用于癌癥模型中定義MDSC的兩個(gè)主要免疫抑制因子（圖1D）；C4和C5簇顯示出重疊的標(biāo)志基因的表達(dá)，包括Cebpe和Retnig等基因；C7和C8簇表現(xiàn)出細(xì)胞周期基因的高表達(dá)，例如Tuba1b和Cdc20，這表明脾臟中存在中性粒細(xì)胞的增殖譜系。

接下來(lái)，研究者將重點(diǎn)放在單核細(xì)胞-限制性的C1簇，該簇在組合分析中顯示出MDSC基因Arg2 和Il1β的彌散表達(dá)（圖1D），這表明M-MDSCs確實(shí)存在，但與單核細(xì)胞相比并沒(méi)有明顯的簇群，因?yàn)榻M合分析中不同細(xì)胞類(lèi)型之間應(yīng)該具有更多實(shí)質(zhì)性的區(qū)別。因此，在去除污染細(xì)胞（比如中性粒細(xì)胞和B細(xì)胞）后，研究者針對(duì)單核細(xì)胞進(jìn)行了聚類(lèi)分析從而鑒定出三種不同的狀態(tài)（簇M0到M2），包括M2簇中的M-MDSC譜系，其在荷瘤PyMT小鼠中高度富集（圖1E）。這些分析為接下來(lái)的G-MDSC和M-MDSC的詳細(xì)分子定義奠定了基礎(chǔ)。研究者的數(shù)據(jù)集代表了一個(gè)有價(jià)值的MDSCs的單細(xì)胞水平轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了G-MDSC和M-MDSC能夠形成獨(dú)特的簇，且它們不同于其正常髓樣對(duì)應(yīng)物。

研究者接著使用scRNAseq數(shù)據(jù)集揭示MDSCs的獨(dú)特分子特征，并闡明定義MDSC狀態(tài)的獨(dú)特生物學(xué)程序。研究者在Seurat中進(jìn)行了差異表達(dá)分析，從而確定來(lái)自荷瘤小鼠的G-和M-MDSCs與正常小鼠的髓樣對(duì)應(yīng)物（即WT小鼠的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞）有何不同（圖1F）。研究者的分析顯示，與正常中性粒細(xì)胞相比，G-MDSCs中有642個(gè)差異表達(dá)的基因，與正常單核細(xì)胞相比，M-MDSCs中有223個(gè)差異表達(dá)的基因，這表明MDSCs與正常髓樣對(duì)應(yīng)物之間的差異很大。G-和M-MDSCs的標(biāo)記基因之間存在大量重疊（200個(gè)高表達(dá)標(biāo)記基因中重疊105個(gè)）（圖1G），表明單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均可獨(dú)立獲得相似的免疫抑制細(xì)胞狀態(tài)。共有的標(biāo)記基因包括參與免疫抑制的基因，比如Il1β、Arg2、Cd84和Wfdc17。據(jù)報(bào)道，干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白1（Ifitm1）參與直腸癌和炎癥性乳腺癌細(xì)胞的進(jìn)展，其在MDSCs中被上調(diào)。其它MDSC標(biāo)志基因包括骨髓-相關(guān)的免疫球蛋白樣受體家族（Cd300ld）、C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員E和D（Clec4e和Clec4d）、IL-1f9（Il1f9）、激活蛋白1轉(zhuǎn)錄因子亞基（Junb）、組織蛋白酶D（Ctsd）、磷脂酶A2Ⅶ組（Pla2g7）以及含5個(gè)半胱氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域（BC100530）。

研究者接著使用Enrichr對(duì)MDSC基因特征進(jìn)行基因本體論（GO）術(shù)語(yǔ)分析。最普遍的GO術(shù)語(yǔ)包括“中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫”“涉及免疫響應(yīng)的中性粒細(xì)胞激活”以及“中性粒細(xì)胞的脫?！保▓D1H）。這些術(shù)語(yǔ)包括編碼補(bǔ)體C5a受體1（C5ar1）、S100鈣結(jié)合蛋白A11（S100a11）、C型凝集素結(jié)構(gòu)域4成員D（Clec4d）、趨化因子受體2（Cxcr2）和骨髓細(xì)胞表明抗原CD33（Cd33）等的基因。正如對(duì)C5ar1和S100a11的報(bào)道，這些因素中的一些促進(jìn)中性粒細(xì)胞和MDSCs的募集。此外，Cd33在MDSCs中特異性表達(dá)，并且目前其作為治療方法的靶標(biāo)。另一個(gè)明顯的GO術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑”（圖1H）包括Il1β、Ifitm1、Junb和Myd88等基因。據(jù)報(bào)道，尤其是Myd88可以促進(jìn)未成熟的Gr1 ⁺細(xì)胞擴(kuò)增，并可能參與介導(dǎo)T細(xì)胞-抑制的細(xì)胞狀態(tài)。此外，該途徑包括與MDSC積累和運(yùn)輸相關(guān)的基因（比如Cxcr2、Csf3r和Ccr1），這表明MDSCs似乎能夠響應(yīng)來(lái)自炎癥部位（例如原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移部位）的募集信號(hào)。

為了驗(yàn)證MDSC基因標(biāo)記，研究者通過(guò)FACS的方法從WT和荷瘤PyMT小鼠的脾臟中分離出CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）。研究者的scRNAseq結(jié)果在這種靶向方法中得到了廣泛的證實(shí)，因?yàn)榕cWT小鼠相比，來(lái)自PyMT小鼠的CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞中MDSC的標(biāo)記基因在很大比例上出現(xiàn)顯著上調(diào)（圖1I）?？傊?，這些結(jié)果表明G-和M-MDSCs共享一套保守的基因特征，并且其與正常的髓樣對(duì)應(yīng)物顯著不同。這種共享的MDSC標(biāo)志基因列表顯示了其與先前MDSCs的整體轉(zhuǎn)錄組水平分析之間存在某些差異和重疊，因此系統(tǒng)地確定這些骨髓細(xì)胞系的整體水平變化是否會(huì)掩蓋MDSC細(xì)胞功能的某些特定程序?qū)⑹钟腥ぁ?/span>

為了確定這種MDSC基因標(biāo)記是否可以推廣并轉(zhuǎn)移到人體環(huán)境中應(yīng)用，研究者探索了最近發(fā)表的scRNAseq免疫細(xì)胞圖譜，包括來(lái)自乳腺癌患者原發(fā)性腫瘤樣本中的T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。研究者在Seurat中對(duì)該數(shù)據(jù)集進(jìn)行了聚類(lèi)分析以繁殖細(xì)胞類(lèi)型標(biāo)記（圖2A），然后對(duì)所有細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行了無(wú)差別的基因標(biāo)記評(píng)分，研究者從中發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中尤其是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)存在MDSC標(biāo)記基因的高表達(dá)（圖2B）。為了評(píng)估擁有特別高MDSC標(biāo)記的中性粒細(xì)胞是否存在不同子集，研究者對(duì)分離的中性粒細(xì)胞進(jìn)行了無(wú)差別聚類(lèi)分析，并產(chǎn)生了四個(gè)不同狀態(tài)的子集（圖2，C和D）。N0簇顯示了MDSC-相關(guān)的標(biāo)記基因S100A9和CCR2，這表明中性粒細(xì)胞的這一亞群代表了乳腺癌患者腫瘤微環(huán)境中的G-MDSCs。使用研究者的MDSC基因標(biāo)記對(duì)這些中性粒細(xì)胞的子集進(jìn)行基因得分分析，結(jié)果確實(shí)顯示目前為止N0簇的細(xì)胞得分最高（圖2E）。此外，研究者對(duì)單核細(xì)胞進(jìn)行了單獨(dú)分析，結(jié)果顯示對(duì)于MDSC標(biāo)記，三個(gè)不同簇之間的得分并不明確（圖2，F和H），表明M-MDSCs在小鼠和人類(lèi)之間可能不具有直接可比性。總之，這些分析證實(shí)了，至少在G-MDSCs背景下，研究者從乳腺癌小鼠模型中得到的MDSC基因標(biāo)記可以轉(zhuǎn)移到人體疾病中應(yīng)用，這表明MDSC的狀態(tài)在小鼠和人類(lèi)之間很大程度上是保守的。

研究者的scRNAseq數(shù)據(jù)揭示了幾種先前未知的MDSC的特異性細(xì)胞表面標(biāo)記，包括CD84和Amica1/JAML。CD84是信號(hào)傳導(dǎo)性淋巴細(xì)胞激活分子家族的細(xì)胞表面受體，并在某些免疫細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)。Amica1/JAML是已知通過(guò)與上皮細(xì)胞表達(dá)的柯薩奇-腺病毒受體（CAR）相互作用從而介導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的連接粘附分子。研究者對(duì)來(lái)自WT和荷瘤PyMT小鼠不同器官的CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞使用FACS進(jìn)行CD84和JAML表達(dá)的分析。研究者首先使用熒光減一（FMO）和同型對(duì)照以確定特異性標(biāo)志基因的表達(dá)。接著，研究者表征了來(lái)自各種器官標(biāo)本（骨髓、肺、脾臟、乳腺脂肪墊（MFP）和原發(fā)性腫瘤）的CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞中CD84和JAML的表達(dá)，并將對(duì)照WT和荷瘤PyMT小鼠進(jìn)行了比較。盡管來(lái)自骨髓和肺的CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞通常對(duì)CD84（圖3A）和JAML（圖3D）呈現(xiàn)陰性，但研究者發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的WT對(duì)照小鼠相比，來(lái)自荷瘤PyMT小鼠脾臟和原發(fā)性腫瘤的大量CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞表現(xiàn)出CD84（圖3B）和JAML（圖3E）的高水平表達(dá)。當(dāng)將所有器官的細(xì)胞并排繪制時(shí)，這一點(diǎn)兒尤為明顯（圖3，C和F）。脾臟和原發(fā)性腫瘤中CD84和JAML的高表達(dá)，這一觀(guān)察結(jié)果與這些部位中CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞的MDSC高容量有關(guān)。

為了確定這些標(biāo)記物的通用性，研究者接著探討了CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞在另外一種乳腺癌小鼠模型中是否表達(dá)CD84：一種在Balb/c小鼠中使用4T1乳腺癌細(xì)胞的原位移植模型。與MMTV-PyMT模型相似，研究者觀(guān)察到CD84的表達(dá)在4T1荷瘤動(dòng)物的脾臟（~21.96%）和原發(fā)性腫瘤（~8.49%）中提高了，而來(lái)自骨髓和肺的CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞中未檢測(cè)到CD84的表達(dá)。此外，研究者通過(guò)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）處理骨髓細(xì)胞來(lái)進(jìn)行MDSC的體外生成。研究者發(fā)現(xiàn)GM-CSF處理后，CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞系中CD84-陽(yáng)性細(xì)胞（~24.45%）和JAML-陽(yáng)性細(xì)胞（~11.26%）均顯著增加。最后，研究者使用先前建立的步驟，即通過(guò)分離外周血單核細(xì)胞（PMBCs）實(shí)現(xiàn)人類(lèi)MDSCs的體外生成，并用GM-CSF和IL-6處理它們（圖3G）。研究者觀(guān)察到與對(duì)照組細(xì)胞相比，體外生成的CD11b ⁺/CD14 ⁺ M-MDSCs和CD11b ⁺/CD15 ⁺ G-MDSCs的樣本中CD84出現(xiàn)顯著上調(diào)（圖3，H到J）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證在這些體外培養(yǎng)基中成功產(chǎn)生了MDSCs，研究者檢測(cè)了CD11b ⁺/CD15 ⁺中性粒細(xì)胞中凝集素型氧化LDL受體1（LOX-1）（先前被用來(lái)定義G-MDSCs）的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)中性粒細(xì)胞中該G-MDSCs標(biāo)志物與CD84的上調(diào)相關(guān)。研究者還檢測(cè)了培養(yǎng)基內(nèi)CD11b ⁺/CD14 ⁺單核細(xì)胞中人類(lèi)白細(xì)胞抗原-DR（HLA-DR）的表達(dá)，該表達(dá)已在體內(nèi)M-MDSCs中下調(diào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)體外產(chǎn)生的M-MDSCs中HLA-DR確實(shí)也下調(diào)了?？傊@些實(shí)驗(yàn)將CD84確立為G-和M-MDSCs的一個(gè)可靠且可推廣的細(xì)胞表面標(biāo)記。

為了在功能上驗(yàn)證CD45⁺CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi細(xì)胞是否抑制免疫細(xì)胞的激活，研究者與之前描述的T細(xì)胞進(jìn)行了共培養(yǎng)（圖4A）。荷瘤小鼠脾臟中的CD45⁺CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi細(xì)胞顯著抑制CD4和CD8 T細(xì)胞的增殖，而來(lái)自荷瘤小鼠的CD45⁺CD11b⁺Gr1⁺CD84^1o細(xì)胞并沒(méi)有明顯的抑制作用（圖4，B和C）。在原發(fā)性腫瘤中，CD84^hi和CD84^lo均表現(xiàn)出T細(xì)胞抑制能力（圖4，D和E），這似乎表明腫瘤微環(huán)境中存在其它因素，這些因素有助于MDSCs的成熟。在與CD84^-/lo細(xì)胞的直接比較中，CD84^hi表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫抑制作用（圖4，D和E）, 這與CD84的表達(dá)是MDSC能力的一個(gè)有力指標(biāo)的觀(guān)點(diǎn)相符。

研究者接下來(lái)檢測(cè)了ROS的產(chǎn)量，并將其作為來(lái)自荷瘤小鼠和對(duì)照小鼠脾臟和原發(fā)性腫瘤的CD11b⁺Gr1⁺CD84^-/lo和CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi細(xì)胞中MDSC功能的標(biāo)志。研究者將ROS的H₂DCFDA染色與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合起來(lái)使用，觀(guān)察到與對(duì)照小鼠的CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞相比，CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi細(xì)胞產(chǎn)生的ROS量顯著更高，而CD11b⁺Gr1⁺CD84^-/lo細(xì)胞的ROS產(chǎn)量則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異（圖4，F和G）。此外，與CD11b⁺Gr1⁺JAML^-/lo細(xì)胞和對(duì)照組CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞相比，來(lái)自荷瘤小鼠脾臟和腫瘤的CD11b⁺Gr1⁺JAML^hi細(xì)胞中ROS產(chǎn)量顯著增加。最后，研究者使用qPCR來(lái)調(diào)查從MDSC標(biāo)志物中選定的基因，發(fā)現(xiàn)與CD11b⁺Gr1⁺CD84^-/lo細(xì)胞相比，CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi細(xì)胞中完整的MDSC相關(guān)基因的表達(dá)提高。這些發(fā)現(xiàn)表明，在CD84高表達(dá)的基礎(chǔ)上，擁有T細(xì)胞抑制和ROS產(chǎn)量能力的MDSC可以被忠實(shí)地檢測(cè)到并被富集。

為了進(jìn)一步區(qū)分MDSCs子集（G-和M-MDSCs）中CD84和JAML的表達(dá)，研究者使用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合CD84或JAML染色調(diào)查了CD45⁺CD11b⁺Ly6C⁺ Ly6G^-（M-MDSCs）和CD45⁺CD11b⁺Ly6C^lo Ly6G⁺（G-MDSCs）。脾臟的M-MDSCs中CD84的檢測(cè)率較低，然而與對(duì)照乳腺細(xì)胞相比，來(lái)自原發(fā)性腫瘤的M-MDSCs中CD84的表達(dá)卻顯著增加（~28.13%）。另一方面，在荷瘤小鼠的原發(fā)性腫瘤（~30.46%）和脾臟（~17.33%）中G-MDSCs均表現(xiàn)出較高的CD84表達(dá)。在荷瘤小鼠脾臟和腫瘤的M-和G-MDSCs中JAML的表達(dá)均上調(diào)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CD84表達(dá)的增加與兩個(gè)MDSC亞組中的功能性MDSC能力有關(guān)，研究者從體外生成的MDSC中分離了Ly6C⁺CD84^hi或Ly6G⁺CD84^hi細(xì)胞，并進(jìn)行了T細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)。Ly6C⁺CD84^hi和Ly6G⁺CD84^hi細(xì)胞抑制CD4和CD8 T細(xì)胞增殖的程度與研究者先前在組合的CD11b⁺/Gr1⁺細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的程度相似。這些發(fā)現(xiàn)表明，G-和M-MDSCs兩個(gè)亞組同時(shí)表達(dá)CD84和JAML，并且能夠抑制T細(xì)胞。

為了在脾臟中重現(xiàn)導(dǎo)致MDSC生成的成熟過(guò)程，并確定其相對(duì)于正常祖細(xì)胞和成熟中性粒細(xì)胞群的分化狀態(tài)，研究者接著使用Monocle對(duì)scRNAseq數(shù)據(jù)集進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的偽時(shí)態(tài)分析排序。研究者重點(diǎn)關(guān)注Ly6g⁺中性粒細(xì)胞子集（圖1,B和C中的C0,C2,C4,C5,C7和C8簇），因?yàn)榕cM-MDSCs相比，研究者在這個(gè)分析中重新獲得足夠多數(shù)量的總中性粒細(xì)胞和G-MDSCs，以確保得到一個(gè)能夠解釋的結(jié)果。研究者首先生成了一個(gè)新的基于Seurat的中性粒細(xì)胞子集，接著使用這組新定義的標(biāo)記基因來(lái)進(jìn)行Monocle分析。結(jié)果導(dǎo)致具有五種不同細(xì)胞狀態(tài)的三分支軌跡出現(xiàn)（圖5A）。為了解釋這種軌跡，研究者將該結(jié)果與近期使用scRNAseq進(jìn)行的工作進(jìn)行了比較，從而定義小鼠骨髓中初生造血干血胞、祖細(xì)胞和分化細(xì)胞狀態(tài)的特征，這表明中性粒細(xì)胞的祖細(xì)胞具有Elane、Mpo和Prtn3等基因標(biāo)記，而成熟的中性粒細(xì)胞表達(dá)Camp、Ltf和Lcn2的水平提高。研究者將這些標(biāo)記與研究者工作中的MDSC標(biāo)記（圖1F）整合在一起，從而能夠注釋這五個(gè)狀態(tài)。首先鑒定的是中性粒細(xì)胞的祖細(xì)胞（狀態(tài)4；Elane-hi），其增殖增加，并形成了偽時(shí)態(tài)分析的開(kāi)始。然后這些祖細(xì)胞在一個(gè)分支上分出成熟的中性粒細(xì)胞（狀態(tài)3；Camp-hi），在在另一分支上分出MDSC（狀態(tài)1；Cd84-hi），正如偽時(shí)態(tài)分析的基因圖中所示（圖5B），這表明G-MDSCs通過(guò)可選擇的成熟過(guò)程從中性粒細(xì)胞的祖細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。

Monocle在MDSC分支的開(kāi)始附近檢測(cè)到另外兩種細(xì)胞狀態(tài)（狀態(tài)2和5）：狀態(tài)5的特征是核糖體基因數(shù)目高，表明翻譯活躍的細(xì)胞狀態(tài)，狀態(tài)2代表MDSC分化的最早階段，其特征是Asprv1、Plscr1和Pirb（成對(duì)的免疫球蛋白樣受體b）的高表達(dá)（圖5C）。據(jù)報(bào)道，中性粒細(xì)胞通過(guò)Asprv1促進(jìn)慢性炎癥，表明Asprv1編碼的天冬氨酸蛋白酶可能在功能上有助于脾臟中MDSCs的出現(xiàn)。此外，Pirb據(jù)報(bào)道調(diào)節(jié)MDSCs的抑制功能和命運(yùn)，表明Pirb是生成MDSC所必需的?？傊@些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明G-MDSCs通過(guò)中性粒細(xì)胞分化的異常形式從中性粒細(xì)胞的祖細(xì)胞中出現(xiàn)，而不是由重編程為免疫抑制細(xì)胞的成熟中性粒細(xì)胞中出現(xiàn)（圖5D）。此外，研究者的工作確定了早期的過(guò)渡性MDSC狀態(tài)，其特征是許多基因僅在分支點(diǎn)附近和MDSC分化過(guò)程中表現(xiàn)出表達(dá)升高，而在正常祖細(xì)胞或成熟中性粒細(xì)胞的軌跡中則沒(méi)有。這可能暗示著過(guò)渡性MDSC狀態(tài)可以作為靶標(biāo)從而阻止其分化為成熟的MDSCs，同時(shí)不影響正常中性粒細(xì)胞的成熟和功能。

研究還采用與上述中性粒細(xì)胞類(lèi)似的方法進(jìn)行了單核細(xì)胞-特異性子集的Monocle分析，產(chǎn)生了類(lèi)似的三分支軌跡，表明在M-MDSC成熟過(guò)程中發(fā)生了一個(gè)類(lèi)似的可替代成熟過(guò)程 。與中性粒細(xì)胞-特異性軌跡分析結(jié)果相反，研究者的單核細(xì)胞-特異性分析中并沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)渡狀態(tài)，這可能是因?yàn)閱魏思?xì)胞中的細(xì)胞數(shù)量較少和潛在過(guò)渡狀態(tài)的覆蓋率降低。

了解腫瘤微環(huán)境抑制活躍的抗腫瘤免疫反應(yīng)的細(xì)胞學(xué)和分子學(xué)機(jī)制，對(duì)于改善目前的癌癥免疫治療方法（比如程序性死亡1（PD-1）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4等查核點(diǎn)抑制劑或嵌合抗原受體T細(xì)胞治療）將十分重要。MDSCs代表一種微環(huán)境成分，在這種環(huán)境中它們通常在癌癥患者中擴(kuò)展，并促進(jìn)各種不同癌癥（包括乳腺癌在內(nèi)）中的晚期腫瘤進(jìn)展和T細(xì)胞抑制。本文中，研究者生成了癌癥期間MDSC成熟的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖，以剖析患乳腺癌小鼠MDSCs的獨(dú)特分子特征，并闡明這些免疫抑制細(xì)胞與其正常髓樣對(duì)應(yīng)物之間的區(qū)別。利用這一資源，研究者確定了MDSC-特異性基因標(biāo)記，該基因標(biāo)記在G-和M-MDSCs之間廣泛共享，但與其正常髓樣對(duì)應(yīng)物有很大不同，同時(shí)通過(guò)分化的異常途徑從中性粒細(xì)胞的祖細(xì)胞中重現(xiàn)了它們的分化軌跡，并鑒定了用于檢測(cè)和未來(lái)MDSCs分離的MDSC-特異性的細(xì)胞表面標(biāo)記。

用于乳腺癌的MMTV-PyMT小鼠模型是為研究乳腺癌而使用最廣泛的模型系統(tǒng)之一，其與人類(lèi)發(fā)病機(jī)理極為相似，并且已經(jīng)知道其在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中會(huì)誘導(dǎo)MDSCs的顯著發(fā)展。研究者在本文中表明脾臟是能夠可靠檢測(cè)到MDSCs的主要器官部位。為了鑒定與MDSC功能相關(guān)的獨(dú)特分子特征，研究者使用scRNAseq作為一種強(qiáng)大且公平的方法來(lái)揭示在單細(xì)胞水平上來(lái)自WT對(duì)照小鼠和荷瘤PyMT小鼠脾臟中經(jīng)FACS-分離的CD45⁺CD11b⁺Gr1⁺細(xì)胞群體中隱藏的變異。該數(shù)據(jù)集不僅提供穩(wěn)態(tài)條件下（WT小鼠）脾臟中單核細(xì)胞/中性粒細(xì)胞異質(zhì)性的單細(xì)胞水平描述，而且闡明了MDSCs如何在單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞類(lèi)似的細(xì)胞中以獨(dú)特簇的形式出現(xiàn)，這使研究者能夠確定MDSC-特異性基因標(biāo)記。G-和M-MDSCs之間存在明顯的重疊，表明單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均具有相似的免疫抑制特征。MDSC標(biāo)記包括與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的各種基因，比如Arg2和Cd84，以及趨化因子受體（如Ccr2和Cxcr2），這表明MDSC響應(yīng)于中性粒細(xì)胞/ MDSC-招募的趨化因子，并指導(dǎo)其遷移至炎癥的活性部位（如原發(fā)性腫瘤或癌癥轉(zhuǎn)移灶）（圖6）。

圖6. 癌癥期間脾臟內(nèi)中性粒細(xì)胞異常分化的建議模型。利用常見(jiàn)的骨髓祖細(xì)胞，骨髓細(xì)胞在骨髓中與造血干細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。常見(jiàn)的粒細(xì)胞/單核細(xì)胞祖細(xì)胞在骨髓中擴(kuò)增并轉(zhuǎn)移到脾臟中形成邊緣池，在那里它們引發(fā)正常的中性粒細(xì)胞成熟，而在癌癥期間通過(guò)異常的中性粒細(xì)胞分化形成G-MDSCs。研究者的發(fā)現(xiàn)表明，MDSC-特異性基因標(biāo)記在G-和M-MDSCs之間基本共享，但不同于它們正常的髓樣對(duì)應(yīng)物。這種MDSC標(biāo)記包括許多趨化因子受體，可能引導(dǎo)它們向原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移部位遷移（如箭頭所示），在那里它們可能庇佑腫瘤細(xì)胞免受抗腫瘤免疫的影響。G-CSF：粒細(xì)胞集落刺激因子。

研究者的發(fā)現(xiàn)表明，G-MDSCs可能通過(guò)異常的分化軌跡從中性粒細(xì)胞的祖細(xì)胞中出現(xiàn)，從而出現(xiàn)正常條件下不存在的細(xì)胞狀態(tài)。使用偽時(shí)態(tài)分析排序調(diào)查研究者觀(guān)察到的細(xì)胞狀態(tài)，并將其與在單細(xì)胞分辨率條件下定義各種造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞狀態(tài)特征的最新研究進(jìn)行了比較，這使研究者能夠從中性粒細(xì)胞的祖細(xì)胞中重現(xiàn)MDSC形成的異常軌跡，這是以犧牲正常分化為成熟中性粒白血球（在荷瘤小鼠中較少）為代價(jià)的（圖5A）。進(jìn)一步調(diào)查分支到G-MDSCs的初始過(guò)渡細(xì)胞狀態(tài)后，研究者發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)在該過(guò)渡期中表達(dá)顯著增加的基因（圖5C），這似乎表明對(duì)這些基因產(chǎn)物進(jìn)行治療性干預(yù)可能會(huì)在MDSC功能活躍前阻止其分化。

盡管本文為MDSC生物學(xué)提供了一些新見(jiàn)解，但本研究的分析仍存在一些潛在的局限性。一個(gè)局限性就是無(wú)法清楚地區(qū)分scRNAseq數(shù)據(jù)中的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。因此，可以想象的是本研究中流式細(xì)胞術(shù)的方法包括來(lái)自脾臟的巨噬細(xì)胞，但是，其在研究者的計(jì)算分析中并沒(méi)有以明顯的簇出現(xiàn)。因此，研究者無(wú)法澄清有關(guān)M-MDSCs作為巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞性質(zhì)這方面的討論。其次，盡管研究者的發(fā)現(xiàn)表明脾臟可能在MDSCs形成和成熟過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但脾臟重要性的問(wèn)題也應(yīng)在未來(lái)的研究中進(jìn)行解決，例如在患癌小鼠模型中進(jìn)行脾切除實(shí)驗(yàn)。最后，本研究?jī)H依賴(lài)于單一癌癥，即乳腺癌。本文報(bào)道的發(fā)現(xiàn)是否適用于其他癌癥背景還有待確定。

對(duì)于研究MDSC的研究人員來(lái)說(shuō)，主要問(wèn)題是用于檢測(cè)和前瞻性分離等功能性調(diào)查的MDSC-特異性細(xì)胞表面受體相對(duì)缺乏。在這里，研究者確定了MDSCs上的CD84和JAML等細(xì)胞表面受體，可將其與CD11b/Gr1染色結(jié)合使用從而檢測(cè)荷瘤小鼠各種器官中MDSCs的存在或與CD11b/CD14或CD15結(jié)合使用檢測(cè)人體內(nèi)MDSCs的存在。CD84參與細(xì)胞間的相互作用，調(diào)控多種免疫細(xì)胞的激活和分化，并作為B細(xì)胞和單核細(xì)胞上的同嗜性粘著分子起作用，同時(shí)在T細(xì)胞中其在較低程度上增強(qiáng)了干擾素-γ的分泌和激活。CD84可以調(diào)節(jié)慢性淋巴細(xì)胞白血病中PD-1/程序性死亡配體1的表達(dá)和功能，從而抑制T細(xì)胞的響應(yīng)和活性，這表明CD84可以使MDSC直接調(diào)節(jié)乳腺癌患者的免疫查核點(diǎn)。

乳腺癌是最普遍的癌癥類(lèi)型之一。在乳腺癌發(fā)生期間，乳腺癌細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子，例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），它們對(duì)造血作用和骨髓細(xì)胞分化產(chǎn)生了系統(tǒng)性的作用，從而促進(jìn)骨髓衍生抑制細(xì)胞（MDSCs）的發(fā)展。但MDSCs的獨(dú)特分子特征目前尚不清楚，其是否代表了一個(gè)與正常、健康的髓樣對(duì)應(yīng)物不同的亞群，這也不清楚，從而極大地限制了人們確定特定MDSC功能的能力。本文中，研究者使用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNAseq）描述了乳腺癌MMTV-PyMT小鼠模型中MDSCs的分子特征。通過(guò)對(duì)scRNAseq數(shù)據(jù)的計(jì)算分析，研究者揭示了獨(dú)特的MDSCs基因標(biāo)記（如CD84和JAML），且這些標(biāo)記在G-和M-MDSCs之間基本共享，但與正常髓樣對(duì)應(yīng)物相比有很大差異。本研究加深了人們對(duì)MDSC生物學(xué)的理解，促進(jìn)了癌癥相關(guān)MDSCs的研究，為乳腺癌的治療提供了新的治療途徑。