原名：Transcriptome analysis of sugar beet (Beta vulgaris L.) in response to alkaline stress

譯名：甜菜對堿脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄組分析

期刊：Plant Molecular Biology

IF：4.06

發(fā)表時間：2020.01

通訊作者：李彩鳳

通訊作者單位：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院

DOI號：10.1007/s11103-020-00971-7   

堿處理對甜菜生理、生長特性產(chǎn)生影響

為測試不同時長堿處理對甜菜生理特性的影響，研究者測量了經(jīng)堿處理0天、3天、7天的甜菜中脯氨酸濃度、POD活性和MDA含量。如圖1a-c所示，不同時長堿處理對以上三項(xiàng)生理特性有顯著影響。這些生理差異表明，經(jīng)過堿處理甜菜的基因表達(dá)情況可能發(fā)生了顯著變化。

為測試長期堿處理對甜菜的影響，研究人員測量了水培甜菜堿處理7天后的生長和光合特性。堿處理組可見形態(tài)變化（圖2a）。堿處理顯著抑制植株生長。堿處理后，植株的光合特性顯著改變（圖2b-d）。例如，堿處理植株中，光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）顯著低于對照組植株（圖2b-d）。然而，堿處理組與對照組之間的光合量子產(chǎn)額未見顯著差異。光合和生長特性的顯著改變說明堿性對植物生長具有抑制作用。

圖1 堿處理對生理特性的影響。a-c 分別為脯氨酸濃度的變化、過氧化物酶（POD）活力的變化、丙二醛（MDA）含量的變化，樣品葉片經(jīng)過0、3、7天處理后采摘。C為對照組，ST為堿處理3天組，LT為堿處理7天組。誤差線代表三個生物學(xué)重復(fù)之間的SD。星號代表堿處理組與對照組之間的顯著性差異（*P < 0.05; **P < 0.01）。

圖2 堿處理對生長特性的影響。a 有/無75μM堿處理水培7天的植株的形態(tài)。b-e 堿處理7天后的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）和光合量子產(chǎn)額（Y（II））。C為對照組，ST為堿處理3天組，LT為堿處理7天組。誤差線代表三個生物學(xué)重復(fù)之間的SD。星號代表堿處理組與對照組之間的顯著性差異（*P < 0.05; **P < 0.01）。

RNA測序數(shù)據(jù)的序列分析及裝配

移除低質(zhì)量接頭和條形碼序列后，從正常組（對照，C）、堿處理3天組（短期處理，ST）、堿處理7天組（長期處理，LT）文庫中分別獲得了9.282、8.851和9.139千萬個原始讀段。獲得了超過97.85%的高質(zhì)量讀段（濾后讀段），可用于下游分析（表1）。比對結(jié)果顯示，67.71%-70.03%的濾后讀段可比對到參照基因組中。在HISAT2工具中，約5.861 (64.52%)、5.474 (63.18%)和5.863 (65.56%) 千萬個分別來自C、ST、LT組文庫的讀段可以唯一地匹配到參照基因組上。從所有樣品的裝配讀段鑒定出25507個基因，可用于堿脅迫下甜菜轉(zhuǎn)錄的后續(xù)分析。 

表1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果統(tǒng)計

差異表達(dá)基因（DEG）的鑒定

對不同狀態(tài)下（C、ST和LT）的甜菜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組比較，構(gòu)建2組配對：ST_vs_C和LT_vs_C。ST_vs_C和LT_vs_C組分別有975、383個顯著DEG（圖3a）。其中，在ST_vs_C和LT_vs_C中均可鑒定的DEG有88個。結(jié)果表明，在對照組和堿處理組之間，基因表達(dá)水平具有顯著差異。ST_vs_C組有573個上調(diào)表達(dá)基因和403個下調(diào)表達(dá)基因，LT_vs_C組有261個上調(diào)表達(dá)基因和122個下調(diào)表達(dá)基因（圖3b、c）。其中，在兩組中均有上調(diào)的DEG有52個，均下調(diào)的DEG有30個。明顯，在堿脅迫下，ST_vs_C和LT_vs_C組的上調(diào)表達(dá)DEG更多。而且，在堿脅迫下， ST_vs_C組組響應(yīng)堿性的DEG多于LT_vs_C組（圖3）。

DEG的GO和KEGG通路分析          

進(jìn)行GO term和KEGG通路功能富集分析，以確定可能參與了堿響應(yīng)的生物過程或通路。在ST_vs_C組中，“氧化還原酶活性”（GO:0016491，56個上調(diào)表達(dá)基因、40個下調(diào)表達(dá)基因）、“結(jié)構(gòu)分子活性”（GO:0005198，12個上調(diào)表達(dá)基因、38 個下調(diào)表達(dá)基因）和“核糖體結(jié)構(gòu)組成”（GO:0003735，4個上調(diào)表達(dá)基因、31個下調(diào)表達(dá)基因）是分子功能（MF）本體下富集程度最高的3個GO term；“單器官代謝過程”（GO:0044710，87個上調(diào)表達(dá)基因、70 個下調(diào)表達(dá)基因）、“氧化還原過程”（GO:0055114，49個上調(diào)表達(dá)基因、48 個下調(diào)表達(dá)基因）和“小分子代謝過程”（GO:0,044,281，33個上調(diào)表達(dá)基因、27個下調(diào)表達(dá)基因）是生物過程（BP）本體下富集程度最高的3個GO term，表明參與這些過程的基因在堿響應(yīng)方面有重要作用（圖4a）。在LT_vs_C組的DEG 中，MF分類下的“輔酶結(jié)合”（GO:0050662，10個上調(diào)表達(dá)基因、5 個下調(diào)表達(dá)基因）、BP分類下的“脂質(zhì)代謝過程” （GO:0006629，10個上調(diào)表達(dá)基因、14 個下調(diào)表達(dá)基因）和“細(xì)胞脂質(zhì)代謝過程”（GO:0044255，6個上調(diào)表達(dá)基因、9 個下調(diào)表達(dá)基因）是富集程度最高的GO term（圖4b）。GO分析可以為DEG功能提供更清晰的理解。

圖3 甜菜兩個比較組的DEG的韋恩圖。a 全部DEG 的分布；b 上調(diào)DEG；c 下調(diào)DEG。

圖4 兩個比較組中DEG富集程度最高的GO term。a ST_vs_C；b LT_vs_C。 MF=分子功能；BP=生物過程；CC=細(xì)胞組成。

為進(jìn)一步研究參與、富集到各代謝通路中的DEG，使用KEGG通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。ST_vs_C組中有630個DEG可歸到90個功能子項(xiàng)下，LT_vs_C組中有223個DEG可歸到68個功能子項(xiàng)下。我們進(jìn)一步鑒定了過度表達(dá)的KEGG本體（KO）term（p<0.05）并將這些term分為12類（表2）。在ST_vs_C組中，在“核糖體”通路中有最多的DEG（48個下調(diào)表達(dá)基因），隨后是“光合器官中的碳固定”（5個上調(diào)表達(dá)基因、5 個下調(diào)表達(dá)基因）（表2）。在LT_vs_C組中，“胞吞作用”（6個上調(diào)表達(dá)基因）、“乙醛酸和二羧酸代謝”（1個上調(diào)表達(dá)基因、4 個下調(diào)表達(dá)基因）和“光合器官中的碳固定”（2個上調(diào)表達(dá)基因、3 個下調(diào)表達(dá)基因）是富集程度最高的KEGG通路（表2）。這些結(jié)果表明，此生代謝可能對堿響應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控具有調(diào)節(jié)作用。這些注釋將為研究甜菜中堿脅迫應(yīng)答的相關(guān)通路提供有價值的參考。

表2 兩個比較組中DEG的KEGG富集分析

差異可變剪接分析

可變剪接（AS）是真核生物基因調(diào)控的重要機(jī)制。研究確認(rèn)了5類主要的AS事件：內(nèi)含子保留（RI）、外顯子跳躍（SE）、可變5’剪接位點(diǎn)（A5SS）、可變3’剪接位點(diǎn)（A3SS）和互斥外顯子（MXE）。本研究在2組比較組中均檢測到差異可變剪接（DAS）。ST_vs_C組 and LT_vs_C組組分別鑒定出289和328個DAS（圖5）（FDR<0.05）。SE和A3SS是最主要的DAS類型（>67%）。

在ST_vs_C組的975個DEG中，8個基因具有DAS。LOC104904993同時具有SE和MXE，LOC104906608只有A3SS。余下6個DEG存在A5SS或SE。在LT_vs_C組的383個DEG中，16個具有DAS。LOC104887494、LOC104892625、LOC104897720和LOC104907230均含有A3SS，LOC104902686 and LOC104902680有A5SS和SE。剩余DEG主要含有A3SS或RI。

與堿脅迫和碳同化相關(guān)的DEG

許多堿誘導(dǎo)的DEG在氧化還原過程中顯著富集。例如，D-3-磷酸甘油酸脫氫酶1基因LOC104901403、亞油酸13S-脂氧合酶2-1基因LOC104889933和2-氧異纈氨?；摎涿竵喕?/span>α1 LOC104895418在ST_vs_C組中顯著上調(diào)（表3）。相反地，谷氨?；?/span>-tRNA還原酶1基因LOC104905095在ST_ vs_C組和LT_vs_C組中均下調(diào)。這些結(jié)果說明，甜菜的氧化還原反應(yīng)顯著地受到堿毒害的影響。另外，在脂質(zhì)代謝過程中，LOC104901567 (脂肪酸過氧化氫酶) 和LOC104900797 (Ω-6 脂肪酸去飽和酶)等基因在堿毒害下表達(dá)水平顯著下調(diào)，表明脂質(zhì)代謝支持了甜菜抵御堿脅迫。植物激素信號傳導(dǎo)和離子平衡在植物堿耐受中具有重要作用。在本研究的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，ST_vs_C組的乙烯不敏感蛋白2基因LOC104884677和LT_vs_C組中的金屬耐受蛋白11基因LOC104886952同時上調(diào)表達(dá)2倍以上。

碳同化在植物生長發(fā)育過程中有重要作用。本研究中，許多DEG在碳固定通路上有顯著富集。其中，鎂螯合亞基Ch1I基因LOC104900584在ST_vs_C組和LT_vs_C組中均有顯著下調(diào)表達(dá)。編碼磷酸海藻糖磷酸酶A（LOC104906608）、果糖二磷酸醛縮酶（LOC104895124）和蔗糖合酶（LOC104901675）基因的表達(dá)水平在ST_vs_C組或LT_vs_C組中下調(diào)超過2倍?？傮w而言，結(jié)果表明甜菜碳同化顯著受到堿毒害的限制。

圖5 兩個比較組中的差異可變剪接（DAS）事件。a ST_vs_C；b LT_vs_C。藍(lán)色柱形為上調(diào)的DAS，紅色柱形為下調(diào)DAS。

表3 一些參與了堿脅迫應(yīng)答和碳代謝的DEG

未注釋DEG

共有32個擁有完整開放閱讀框（ORF）的基因在Genbank中無注釋，且它們的表達(dá)水平在脅迫下發(fā)生變化。例如，假定蛋白LOC104897954在LT_vs_C組中上調(diào)表達(dá)超過16倍。這說明許多未知基因可能參與了堿脅迫耐受。

qRT?PCR 驗(yàn)證

為確認(rèn)Illumina的RNA測序結(jié)果的精確性和重現(xiàn)性，研究人員以定量實(shí)時PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證堿處理前后8個代表性基因的表達(dá)水平。所選基因的相對表達(dá)量進(jìn)一步與RNA測序結(jié)果比較。qRT-PCR結(jié)果中，基因表達(dá)模式的相對趨勢與RNA測序的結(jié)果一致，支持了RNA測序結(jié)果的可靠性。（圖6）

圖6 RNA測序結(jié)果與基因表達(dá)水平的qRT-PCR分析。a ST_vs_C 中，8個基因的Log2變化倍數(shù)；b LT_vs_C 中，8個基因的Log2變化倍數(shù)。

堿性是一種具有高度脅迫性的環(huán)境因子，限制了植物的生長繁殖。堿脅迫和鹽脅迫常具有內(nèi)在聯(lián)系，會引發(fā)混合效應(yīng)，如滲透性、專性離子和高pH效應(yīng)，而且難以控制和改變。因此，闡明植物堿耐受機(jī)制、培育一系列新型耐鹽堿作物，對于改良鹽堿土壤乃至實(shí)現(xiàn)糧食增產(chǎn)，都是很有必要的。甜菜被人們持續(xù)廣泛地作為作鹽生作物栽培，是相對耐堿性的作物。近年研究通過形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和分子響應(yīng)等方面為植物脅迫耐受分子機(jī)制提供了有價值的信息。但關(guān)于甜菜的對堿性毒害耐受的分子機(jī)制未見報道。

理解甜菜堿性脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，或許有助于發(fā)現(xiàn)增加藜屬植物及其他植物耐堿性的新方法。而且，通過RNA測序進(jìn)行詳細(xì)的轉(zhuǎn)錄組分析可以用于厘清植物體內(nèi)堿性響應(yīng)基因表達(dá)的調(diào)控以及耐堿機(jī)制。植物對堿性脅迫的響應(yīng)涉及到了伴隨基因表達(dá)變化的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。因此，為能夠更深刻地理解基因?qū)用娴淖兓芯空邔θN實(shí)驗(yàn)條件下（對照、短期堿性脅迫、長期堿性脅迫）的甜菜使用轉(zhuǎn)錄組分析。統(tǒng)計分析表明，共有25507個基因在3組甜菜樣品中有表達(dá)。進(jìn)一步從配對組中篩選基因表達(dá)水平具有巨大差異且p<0.05的DEG，最終選出了1270個重要的堿性響應(yīng)基因。

GO富集分析被用于揭示GO term的富集偏好和DEG的假定功能注釋。GO富集分析顯示，DEG富集到了對刺激或脅迫響應(yīng)方面，如對氧化壓力、金屬離子、革蘭氏陰性菌、藥物刺激、化學(xué)脅迫、DNA損傷刺激和生物性刺激等。與鹽分脅迫類似，堿性脅迫也是一種典型的非生物脅迫，DEG在刺激、脅迫term上的富集也說明，所選擇的DEG可能是實(shí)際上的堿性脅迫DEG。根據(jù)本研究中的轉(zhuǎn)錄組GO分析結(jié)果，DEG主要與氧化還原和脂質(zhì)代謝有關(guān)。例如，D-3-磷酸甘油酸脫氫酶1基因LOC104901403、亞油酸13S-脂氧合酶2–1基因LOC104889933和2-氧異纈氨?；摎涿竵喕?/span>α1 LOC104895418均在ST_vs_C組中顯著上調(diào)表達(dá)。相反地，谷氨酰-tRNA還原酶1基因LOC104905095在ST_vs_C組和LT_vs_C組均下調(diào)表達(dá)。此外，LOC104901567（脂肪酸脂氫過氧化物裂解酶）和LOC104900797（Ω-6脂肪酸去飽和酶）等脂質(zhì)代謝過程中的基因的表達(dá)水平在堿性毒害下顯著改變。這些結(jié)果說明，氧化還原和脂質(zhì)代謝在甜菜的堿性脅迫耐受方面有關(guān)鍵作用。

KEGG富集分析可確認(rèn)上述1270個重要的堿性響應(yīng)DEG的相關(guān)通路。碳代謝是植物中最重要的代謝過程。碳同化保障了植物生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究中，若干DEG富集到“光合器官中的碳固定”通路，進(jìn)一步闡明了堿性脅迫對植物碳同化的抑制作用。而且，一些DEG在“乙醛酸和二羧酸代謝”通路中富集，說明了次生代謝可能參與了甜菜的堿性脅迫耐受。

堿性毒害可激活植物中激素依賴性信號通路并誘導(dǎo)激素生物合成基因表達(dá)。在非生物脅迫應(yīng)答中，乙烯信號會與他激素發(fā)生串?dāng)_。Win等人發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性乙烯水平影響植物生長和養(yǎng)分吸收。本研究中，ST_vs_C組乙烯不敏感蛋白2基因LOC104884677的表達(dá)水平顯著上調(diào)，說明乙烯這一重要的光合激素信號傳導(dǎo)元素在甜菜的堿性毒害響應(yīng)中發(fā)揮了作用。日益增加的證據(jù)表明，維持芽中高K+/ Na+比的能力對植物堿性耐受至關(guān)重要。本研究中，LT_vs_C組的金屬耐受蛋白11基因LOC104886952上調(diào)表達(dá)超過2倍。這說明甜菜中與離子平衡相關(guān)的基因被堿性條件激活。

近期研究發(fā)現(xiàn)，AS事件是普遍存在于植物中的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。AS事件通常導(dǎo)致動植物體內(nèi)產(chǎn)生多種蛋白，繼而增加了生物多樣性。人們注意到，一些由特定AS轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的蛋白，也和植物中的堿性脅迫應(yīng)答有關(guān)。本研究中，ST_vs_C組和LT_vs_C組分別出現(xiàn)了8個、16個擁有DAS的基因。含有DAS的基因的出現(xiàn)，可能是甜菜用于節(jié)約能量的脅迫適應(yīng)機(jī)制。因此，與DAS相關(guān)的基因可能在堿性脅迫適應(yīng)中有重要作用。本研究中，DEG的AS類型主要為A3SS和SE。例如，堿性脅迫下，LOC104906608、LOC104897720和LOC104907230含有A3SS，LOC104904993和LOC104902680含有SE。上述結(jié)果表明，A3SS和SE可能在甜菜對堿性脅迫適應(yīng)的過程中有重要作用。

此外，本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示了32個包含完整ORF的無注釋基因在堿性脅迫下發(fā)生了上調(diào)表達(dá)。例如，假定蛋白LOC104897954在ST_vs_C組中上調(diào)了超過16倍，而LOC104906052在LT_vs_C組下調(diào)超過4倍。這些結(jié)果表明，以上無注釋基因可能在甜菜的堿性脅迫耐受方面有重要作用。