1.人參皂苷Rb1減少再灌注后琥珀酸酯驅(qū)動(dòng)的ROS產(chǎn)生

線粒體ROS在原代成年小鼠心肌細(xì)胞中受到I/R損傷后迅速增加，但通過(guò)人參皂苷Rb1預(yù)處理而被阻止（圖1A）。因?yàn)榉e累的琥珀酸酯是再灌注后線粒體ROS產(chǎn)生的驅(qū)動(dòng)力，所以我們用細(xì)胞滲透性琥珀酸二甲酯處理了心肌細(xì)胞，并通過(guò)寡霉素抑制ATP合酶來(lái)模仿RET介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。由于抑制ATP合酶引起了高Δψm，琥珀酸誘導(dǎo)了ROS的增加，而人參皂苷Rb1的預(yù)處理降低了琥珀酸誘導(dǎo)的ROS釋放（圖1B）。為了證實(shí)其在體內(nèi)的作用，我們使用了線粒體靶向的ROS探針MitoB來(lái)量化遭受I/R損傷的小鼠心臟中ROS的產(chǎn)生。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1的給藥在再灌注階段早期有效地阻斷了線粒體ROS的產(chǎn)生（圖1C），并且人參皂苷Rb1減弱了DNA的氧化損傷（圖1D）。此外，我們觀察到，再灌注前人參皂苷Rb1的使用在I/R手術(shù)后的第14天顯著降低了ROS的水平，這種作用甚至在第28天仍然存在（圖1E-F）。                         

圖1 人參皂苷Rb1減少了再灌注時(shí)琥珀酸酯驅(qū)動(dòng)的ROS的產(chǎn)生

A.用線粒體超氧化物歧化酶(MitoSOX Red)超氧化物指示劑檢測(cè)缺氧/復(fù)氧處理的成人原代心肌細(xì)胞的ROS生成。B.用琥珀酸二甲酯(Suc)和寡霉素(Olego)處理原代心肌細(xì)胞2h后ROS的生成。C.觀察人參皂甙Rb1對(duì)再灌注15min后心肌細(xì)胞ROS生成的抑制作用。D.缺血30min再灌注15min小鼠心臟8-羥基鳥(niǎo)苷(8-OHG)免疫組織化學(xué)染色。人參皂苷Rb1預(yù)處理對(duì)再灌注后第14天(E)或28天(F)心臟ROS水平的影響。

2. 人參皂苷Rb1引起的ROS減少可保護(hù)心肌細(xì)胞免受急性I/R損傷

I/R損傷線粒體功能，如引起原代心肌細(xì)胞中MPTP的打開(kāi)和Δψm的改變（圖2A-B），人參皂苷Rb1預(yù)處理可防止這些改變，并且人參皂苷Rb1相應(yīng)地減少了細(xì)胞死亡（圖2C）；同樣，人參皂苷Rb1在I/R損傷有效減少了心肌細(xì)胞凋亡（圖2D）。人參皂苷Rb1在缺血前和再灌注開(kāi)始時(shí)均顯著減少了梗塞面積（圖2E）。但是，再灌注后15分鐘給藥時(shí)我們未觀察到這種保護(hù)作用（圖2E），這表明及時(shí)干預(yù)對(duì)心臟保護(hù)至關(guān)重要。 

圖2 人參皂苷Rb1引起的ROS減少可保護(hù)心肌細(xì)胞免受急性I/R損傷

A-C，成年原代心肌細(xì)胞用人參皂甙Rb1(10μM)處理，低氧(1%O2)1h后復(fù)氧1h(H/R)。測(cè)定線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(A)、4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性圖像和線粒體電位定量(Δψm) (B)，以及細(xì)胞存活率(C)。D.缺血30min再灌注24h小鼠心臟典型圖像及TUNEL染色。E，心肌缺血再灌注損傷小鼠，在缺血前、再灌注開(kāi)始時(shí)和再灌注15min后給予人參皂甙Rb1TTC染色的代表性照片。

3. 再灌注前人參皂苷Rb1的給藥有助于改善恢復(fù)過(guò)程中的心臟功能

再灌注期間ROS的產(chǎn)生是心臟功能受損，預(yù)后不良的原因。我們觀察到，在缺血之前人參皂苷Rb1的給藥可維持心臟功能，并防止I/R損傷后2周的小鼠線粒體腫脹（圖3A-B）。心臟基因譜分析的相應(yīng)結(jié)果表明，與心肌纖維化相關(guān)的幾種生物學(xué)途徑均受到影響。這些基因集與TGF-β信號(hào)通路和ECM-受體相互作用有關(guān)，在再灌注前人參皂苷Rb1逆轉(zhuǎn)它們的上調(diào)（圖3C）。隨著心臟損傷的進(jìn)展，缺血前人參皂苷Rb1的給藥可在I/R損傷后28天中保持小鼠心臟功能并減輕心臟纖維化（圖3D）。這些結(jié)果表明，再灌注前給予人參皂苷Rb1不僅減少了急性心肌細(xì)胞的損害，而且在恢復(fù)過(guò)程中也有助于改善心臟功能。

圖3 再灌注前人參皂苷Rb1的給藥有助于恢復(fù)過(guò)程中心臟功能的改善

A.I/R損傷后14d心功能測(cè)定。B.I/R損傷后14d測(cè)定心肌線粒體結(jié)構(gòu)。C.I/R損傷后14天測(cè)量心臟基因圖譜。D.小鼠心肌缺血再灌注28d后心臟立體、典型圖像及Masson's三色染色定量。 

4.蛋白質(zhì)組學(xué)揭示人參皂苷Rb1調(diào)節(jié)線粒體復(fù)合體I

因?yàn)榫€粒體ROS引起再灌注損傷，所以我們從接受I/R損傷的小鼠心臟中純化了線粒體，以進(jìn)行基于TMT的定量蛋白質(zhì)組分析。在不存在其他蛋白質(zhì)的情況下，線粒體蛋白質(zhì)中禁止素的相對(duì)強(qiáng)度顯著增加，表明其高純度和富集（圖4A）。有17262個(gè)肽被映射到3054個(gè)蛋白質(zhì)中（圖4B），以p值<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，我們發(fā)現(xiàn)591個(gè)顯著變化的蛋白質(zhì)。與對(duì)照組相比，I/R組的186個(gè)蛋白表達(dá)升高，而405個(gè)蛋白表達(dá)降低（圖4B）。PCA分析表明，I/R組與對(duì)照組明顯分離，人參皂苷Rb1處理可部分逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)模式（圖4C）。

接下來(lái)，根據(jù)它們的變化趨勢(shì)，我們將這些差異蛋白分為4個(gè)簇（圖4D）。在I/R組中，簇1中的蛋白質(zhì)高度增加，但在人參皂苷Rb1處理組中明顯減少。I/R組簇2中的蛋白質(zhì)表達(dá)減少，而人參皂苷Rb1處理組中的蛋白質(zhì)表達(dá)增加；人參皂苷Rb1處理對(duì)簇3和4中的蛋白質(zhì)沒(méi)有影響，這些結(jié)果表明，簇1和2中的蛋白質(zhì)被人參皂苷Rb1調(diào)節(jié)。對(duì)簇1和2的GO分析表明，這些蛋白質(zhì)的分子功能與氧化還原酶和NADH脫氫酶活性密切相關(guān)（圖4E）。有趣的是，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析表明，這些蛋白質(zhì)彼此相互作用，并與氧化磷酸化和核糖體功能有關(guān)（圖4F）。具體而言，線粒體復(fù)合體I蛋白在心肌損傷中上調(diào)，但被人參皂苷Rb1挽救到正常水平（圖4F）。表1列出了在再灌注早期人參皂苷Rb1對(duì)線粒體復(fù)合體I蛋白的調(diào)節(jié)作用，其中，通過(guò)人參皂苷Rb1處理可顯著拯救位于NADH脫氫酶（N模塊）亞單位中的蛋白質(zhì)，例如Ndufv1，Ndufv2，Ndufs1，Ndufs4，Ndufs6和Ndufa12（圖4G，表1）。綜上所述，這些結(jié)果表明人參皂苷Rb1可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體復(fù)合體I中的蛋白質(zhì)來(lái)保護(hù)心臟免受I/R損傷。 

圖4 蛋白質(zhì)組學(xué)揭示人參皂苷Rb1調(diào)節(jié)線粒體復(fù)合體I

C57BL/6J小鼠腹腔注射人參皂苷Rb1(50mg/kg)，心肌缺血30min，再灌注15min。提取心肌組織線粒體蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。A.Western blot檢測(cè)從心臟組織中提取的濃縮線粒體片段的純度。B.缺血/再灌注(I/R)組和假手術(shù)組比較，蛋白質(zhì)有明顯變化。C.假手術(shù)組(Sham)、缺血再灌注組(I/R)和I/R+人參皂苷Rb1治療組(I/R+Rb1)的主成分分析(PCA)。D.根據(jù)假手術(shù)組、I/R組和I/R+Rb1組的變化趨勢(shì)對(duì)差異顯著的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類分析。每條折疊線代表一種蛋白質(zhì)的變化趨勢(shì)。定位于簇1和簇2的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是被人參皂苷Rb1拯救或調(diào)節(jié)的。E.使用基因本體論(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)人參皂苷Rb1拯救或調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分類。利用string數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)人參皂苷Rb1挽救或調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析。紅色和藍(lán)色表示人參皂苷Rb1拯救或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的程度。G.人參皂苷Rb1處理挽救或調(diào)節(jié)的線粒體復(fù)合體I中定位蛋白的分布示意圖。

表1 人參皂苷Rb1對(duì)再灌注早期線粒體復(fù)合體I蛋白的調(diào)節(jié)

5.人參皂苷Rb1選擇性抑制線粒體復(fù)合體I的活性，但不抑制復(fù)合體II和IV的活性

接下來(lái)，我們檢查了人參皂苷Rb1是否調(diào)節(jié)線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈功能。盡管對(duì)基礎(chǔ)OCR沒(méi)有顯著影響，但人參皂苷Rb1顯著抑制了最大呼吸，而不會(huì)影響對(duì)抗霉素A不敏感的非線粒體O₂的消耗（圖5A）。當(dāng)丙酮酸和蘋(píng)果酸用作底物時(shí)，人參皂苷Rb1處理抑制了心肌細(xì)胞中復(fù)合體I依賴性O(shè)₂消耗（圖5B）；同樣，人參皂苷Rb1在分離的線粒體中抑制線粒體復(fù)合體I的活性（圖5C）。不同的是，魚(yú)藤酮不可逆地抑制線粒體復(fù)合體I活性，而洗脫掉人參皂苷Rb1之后，線粒體復(fù)合體I的活性可以恢復(fù)（圖5D）。該結(jié)果表明人參皂苷Rb1的抑制作用是可逆的。當(dāng)我們將琥珀酸酯用作復(fù)合體II激活的底物時(shí)，人參皂苷Rb1不會(huì)改變完整心肌細(xì)胞中的O₂消耗，并且它也不能抑制分離的線粒體中的線粒體復(fù)合體II活性（圖5E）；同樣，人參皂苷Rb1對(duì)線粒體復(fù)合體IV依賴的呼吸作用和復(fù)合體IV活性也沒(méi)有影響（圖5F）。綜上所述，這些結(jié)果表明人參皂苷Rb1以可逆的方式特異性抑制線粒體復(fù)合體I的活性。

圖5 人參皂苷Rb1選擇性抑制線粒體復(fù)合體I的活性，但不抑制復(fù)合體II和IV的活性A.H9c2細(xì)胞在人參皂苷Rb1(10μM)、FCCP(2.5μM)、丙酮酸(PYR，10mM)和抗霉素A(AA，1μM)存在下的耗氧率(OCR，%基線)。B.用洋地黃(3μg/mL)滲透H9c2細(xì)胞，然后用ADP(1 MM)、丙酮酸(5 MM)、蘋(píng)果酸(5 MM)和Rb1(10μM)刺激H9c2細(xì)胞。C.人參皂苷Rb1(10μM)或魚(yú)藤酮(1μM)對(duì)H9c2細(xì)胞線粒體復(fù)合體I活性的影響。D.OCR檢測(cè)ADP(1 MM)、谷氨酸(5 MM)+蘋(píng)果酸(5 MM)和琥珀酸(5 MM)對(duì)H9c2細(xì)胞通透性的影響。在此，H9c2細(xì)胞在OCR測(cè)量前用人參皂苷Rb1(10μM)或魚(yú)藤酮(1μM)預(yù)處理1h。E.在琥珀酸(5 MM)、魚(yú)藤酮(0.5μM)和人參皂苷Rb1(10μM)存在下，通透性H9c2細(xì)胞的E、OCR(%基線)。F.注射FCCP(2.5μM)、TMPO(0.4mM)+抗壞血酸(0.4 mM)、人參皂苷Rb1(10μM)和疊氮(5 MM)的H9c2細(xì)胞的OCR(%基線)。

6. 人參皂苷Rb1可逆地抑制線粒體復(fù)合體I的NADH脫氫酶

復(fù)合體I的NADH脫氫酶是產(chǎn)生ROS的候選位點(diǎn)。由于蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，屬于NADH脫氫酶亞基的差異蛋白的水平隨I/R損傷而改變，因此我們檢查了這些蛋白的基因和蛋白表達(dá)。I/R處理上調(diào)了心肌細(xì)胞中Ndufv1，Ndufv2，Ndufs1，Ndufs4和Ndufa12的mRNA表達(dá)，但人參皂苷Rb1預(yù)處理降低了這些增加的基因表達(dá)（圖6A）。在I/R條件下，NADH脫氫酶這些亞基的基因敲低減少了ROS的產(chǎn)生并保護(hù)了細(xì)胞的活力（圖6B-C）。人參皂苷Rb1在基礎(chǔ)和I/R條件下均降低了心肌細(xì)胞線粒體復(fù)合體I的NADH脫氫酶活性（圖6D-E）。線粒體復(fù)合體I抑制劑魚(yú)藤酮不能抑制NADH脫氫酶，因?yàn)樗c泛醌結(jié)合，而不是NADH脫氫酶。人參皂苷Rb1的洗脫恢復(fù)了NADH脫氫酶的活性，表明人參皂苷Rb1對(duì)復(fù)合體I的抑制作用是可逆的（圖6F）。為了確認(rèn)人參皂苷Rb1調(diào)控NADH脫氫酶的特殊作用，我們將編碼釀酒酵母內(nèi)部NADH脫氫酶的基因轉(zhuǎn)染到了H9c2細(xì)胞中。Ndi1是單個(gè)多肽，可作為哺乳動(dòng)物線粒體呼吸鏈中復(fù)合體I的替代分子。人參皂苷Rb1無(wú)法降低Ndi1表達(dá)細(xì)胞中的OCR（圖6G）；同樣，表達(dá)Ndi1的細(xì)胞對(duì)人參皂苷Rb1在I/R刺激下對(duì)ROS產(chǎn)生的抑制作用具有抗性（圖6H），而Ndi1的表達(dá)加重了RET介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，并逆轉(zhuǎn)了人參皂苷Rb1的抑制作用（圖6I）。這些結(jié)果表明人參皂苷Rb1的心臟保護(hù)作用可能是由于其抑制了線粒體復(fù)合體I中的NADH脫氫酶活性。 

圖6 人參皂苷Rb1可逆地抑制線粒體復(fù)合體I的NADH脫氫酶

A.缺氧再灌注心肌細(xì)胞Ndufv1、Ndufv2、Ndufs1、Ndufs4、Ndufs6和Ndufa12的mRNA表達(dá)。轉(zhuǎn)染Ndufv1、Ndufv2、Ndufs1、Ndufs4、Ndufs6和Ndufa12 siRNA的H9c2細(xì)胞的B-C、ROS水平(B)和細(xì)胞存活率(C)。D.人參皂苷Rb1或魚(yú)藤酮對(duì)成人原代心肌細(xì)胞NADH脫氫酶活性的影響。E.成年原代心肌細(xì)胞缺氧(1h)再灌注15min后NADH脫氫酶活性。F.成年原代心肌細(xì)胞用人參皂苷Rb1(10μM)預(yù)處理1h，然后將人參皂苷Rb1留在原代心肌細(xì)胞上進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)定，或?qū)⑷藚⒃碥誖b1洗掉，繼續(xù)培養(yǎng)1h，測(cè)定NADH脫氫酶活性。G.Ndi1蛋白在轉(zhuǎn)染Ndi1質(zhì)粒的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)。在人參皂苷Rb1(10μM)、FCCP(2.5μM)、丙酮酸(PYR，10 mM)和抗霉素A(AA，1μM)存在下，Ndi1表達(dá)細(xì)胞的耗氧率(OCR，%基線)。H.Ndi1蛋白表達(dá)。缺氧/再灌注損傷時(shí)表達(dá)Ndi1的細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。I. Ndi1蛋白表達(dá)。琥珀酸二甲酯和寡霉素作用于表達(dá)Ndi1細(xì)胞2h后產(chǎn)生的ROS。

7.人參皂苷Rb1控制線粒體復(fù)合體I的活性/去活性轉(zhuǎn)變，以調(diào)節(jié)NADH脫氫酶活性

在I/R損傷中，線粒體復(fù)合體I的活性/失活轉(zhuǎn)變與ROS的產(chǎn)生高度相關(guān)，呼吸系統(tǒng)復(fù)合體I的失活形式被認(rèn)為是Na⁺/H⁺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此，我們?cè)贖9c2細(xì)胞中測(cè)量了線粒體基質(zhì)的pH（圖7A）。在缺血狀態(tài)下，線粒體內(nèi)pH較低，但對(duì)再灌注響應(yīng)升高（圖7A）。人參皂苷Rb1處理在再灌注后可使線粒體內(nèi)pH保持在較低水平，這表明人參皂苷Rb1使線粒體復(fù)合體I保持失活狀態(tài)（圖7A）。響應(yīng)缺血或溫度處理而發(fā)生的構(gòu)象變化導(dǎo)致線粒體亞基ND3內(nèi)關(guān)鍵Cys-39的暴露，可以用巰基特異性試劑標(biāo)記線粒體復(fù)合體I的失活（圖7B）；此外，人參皂苷Rb1在再灌注中保護(hù)了ND3在小鼠心臟中的暴露，進(jìn)一步證實(shí)了人參皂苷Rb1對(duì)體內(nèi)線粒體復(fù)合體I狀態(tài)的影響（圖7C）。為了揭示潛在的機(jī)制，我們進(jìn)行了分子對(duì)接，以測(cè)試人參皂苷Rb1與復(fù)合體I中參與活性/失活轉(zhuǎn)變的亞基（ND3，ND1和Ndufa9）之間的潛在相互作用，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1與Cys-39，Tyr-37和Asp-42的ND3氨基酸殘基相互作用（圖7D）。為了確認(rèn)人參皂苷Rb1是否直接靶向ND3，我們進(jìn)行了表面等離子體共振技術(shù)，結(jié)果表明人參皂苷Rb1對(duì)ND3表現(xiàn)出很強(qiáng)的結(jié)合親和力（圖7E）。這些結(jié)果表明人參皂苷Rb1可能通過(guò)與復(fù)合體I中的ND3亞基結(jié)合而使酶陷入失活構(gòu)象。失活狀態(tài)的特征是與活性構(gòu)象相比，NADH脫氫酶活性較低。通過(guò)限制處于失活狀態(tài)的線粒體復(fù)合體I，人參皂苷Rb1處理在再灌注或再激活階段具有較低的NADH脫氫酶活性（圖7F）。 

圖7 人參皂苷Rb1控制線粒體復(fù)合體I的活性/去活性轉(zhuǎn)變，以調(diào)節(jié)NADH脫氫酶活性

A.有絲分裂細(xì)胞線粒體定位的代表性圖像。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MITO-Sypher的H9c2細(xì)胞。B.線粒體復(fù)合體的BODIPY-TMR標(biāo)記示意圖。C.I/R損傷時(shí)小鼠心臟線粒體蛋白的BODIPY-TMR信號(hào)(左)。D. AutoDock預(yù)測(cè)人參皂苷Rb1與參與活性/失活轉(zhuǎn)換的線粒體復(fù)合物I亞基(ND3、ND1和NDUfa9)之間的結(jié)合模式。E.人參皂苷Rb1與人重組ND3蛋白結(jié)合的SPR分析。F.人參皂苷Rb1(10μM)處理H9c2細(xì)胞，缺氧1h，復(fù)氧和不復(fù)氧15min下的線粒體復(fù)合物I活性。

再灌注后，琥珀酸脫氫酶激活會(huì)由于RET而驅(qū)動(dòng)復(fù)合體I上ROS生成，而通過(guò)抑制復(fù)合體I可以抑制以這種方式生成ROS。魚(yú)藤酮通過(guò)調(diào)節(jié)泛醌以減弱電子通量來(lái)抑制復(fù)合體I活性；另外，線粒體復(fù)合體I在特定部位的S-亞硝化可限制再灌注時(shí)ROS的產(chǎn)生。在本篇文章中，我們確定了線粒體復(fù)合體I中的NADH脫氫酶亞基蛋白是人參皂苷Rb1調(diào)控的潛在靶標(biāo)。由于線粒體ROS的產(chǎn)生是再灌注損傷的最初原因，人參皂苷Rb1抑制NADH脫氫酶的活性，從而阻止了ROS的產(chǎn)生，表明其在心臟保護(hù)中的特殊作用。

在處理急性心肌缺血中，及時(shí)進(jìn)行再灌注對(duì)于挽救心肌至關(guān)重要；但是，這種干預(yù)受到了再灌注損傷的挑戰(zhàn)。據(jù)報(bào)道，致命的心肌再灌注損傷可能占最終梗死面積的50％，盡管涉及許多病理生理因素，但線粒體ROS的產(chǎn)生已成為導(dǎo)致I/R引起組織損傷的一系列事件的最初原因。人參皂苷Rb1已被證明可以保護(hù)心臟免受I/R損傷，我們進(jìn)一步證實(shí)，這種心臟保護(hù)作用很大程度上取決于再灌注后對(duì)ROS的抑制作用。在缺血性心臟中，在再灌注的早期會(huì)迅速產(chǎn)生過(guò)量的ROS，而在I/R損傷之前給予人參皂苷Rb1可以減少ROS的產(chǎn)生并防止心臟中的DNA氧化損傷。由于缺血的預(yù)防性治療在臨床上不可行，因此我們?cè)谠俟嘧㈤_(kāi)始時(shí)研究了人參皂苷Rb1的治療方法并確認(rèn)了其保護(hù)作用。但是，再灌注后15分鐘給藥無(wú)法保護(hù)心臟。重要的是，再灌注前人參皂苷Rb1的治療可提供長(zhǎng)期的心臟保護(hù)作用。因?yàn)樵谠俟嘧⒌那?0–20分鐘內(nèi)過(guò)量的ROS產(chǎn)生對(duì)于急性和長(zhǎng)期心臟損害都是至關(guān)重要的，所以我們認(rèn)為在再灌注早期抑制ROS產(chǎn)生是人參皂苷Rb1主要的保護(hù)機(jī)制。

線粒體ROS通常被認(rèn)為是ETC損壞引起的，因?yàn)樵黾拥碾娮有孤?huì)在復(fù)合體I和III上產(chǎn)生超氧化物。抑制復(fù)合體I會(huì)阻止電子沿著ETC流動(dòng)，從而導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加。當(dāng)電子無(wú)法轉(zhuǎn)移到CoQ時(shí)，高度還原的FMN驅(qū)動(dòng)電子泄漏以生成ROS；然而，最近的一項(xiàng)研究表明，線粒體復(fù)合體I的抑制在再灌注的早期階段有助于減弱RET介導(dǎo)的ROS爆發(fā)。再灌注后，線粒體復(fù)合體II的琥珀酸氧化生成大量電子提供燃料，從而導(dǎo)致最大Δψm并大大降低了CoQ池。然后，高膜電位迫使電子從CoQ池向復(fù)合體I中的FMN流動(dòng)，從而產(chǎn)生ROS。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1調(diào)節(jié)線粒體ETC功能。研究者們已經(jīng)使用了許多蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)來(lái)確定缺血性心臟病的潛在治療靶點(diǎn)，在本研究中，蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明人參皂苷Rb1可能通過(guò)調(diào)節(jié)復(fù)合體I活性來(lái)保護(hù)心臟免受I/R損傷?？傊@些數(shù)據(jù)表明人參皂苷Rb1通過(guò)調(diào)節(jié)復(fù)合體I活性阻止了RET介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。

復(fù)合體I是NADH：泛醌氧化還原酶，它利用NADH氧化和泛醌還原作用生成ATP。哺乳動(dòng)物復(fù)合體I包含三個(gè)結(jié)構(gòu)模塊：N，Q和P。其中，N-模塊（脫氫酶模塊）包含Ndufv1，Ndufv2，Ndufs1，Ndufs4，Ndufs6等。通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)心臟受到I/R損傷時(shí)，線粒體復(fù)合體I中的NADH脫氫酶亞基為人參皂苷Rb1調(diào)節(jié)的潛在效應(yīng)蛋白。與已發(fā)表的研究表明這些亞基的化學(xué)修飾或遺傳損失可以保護(hù)心臟免受缺血性應(yīng)激的影響一致，我們證明了這些亞基的敲除減少了ROS的產(chǎn)生并保護(hù)了心肌細(xì)胞。為了進(jìn)一步證實(shí)人參皂苷Rb1在抑制NADH脫氫酶中的特殊作用，我們?cè)谛募〖?xì)胞中過(guò)表達(dá)Ndi1，其中，Ndi1是編碼釀酒酵母線粒體對(duì)魚(yú)藤酮不敏感的內(nèi)部NADH-醌氧化還原酶的基因，可以將其轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的線粒體中，作為復(fù)合體I的替代分子，將電子從NADH轉(zhuǎn)移到泛醌庫(kù)中。人參皂苷Rb1不能抑制表達(dá)Ndi1的細(xì)胞中的復(fù)合體I活性和減少ROS的產(chǎn)生，支持了我們的推測(cè)，即它通過(guò)抑制NADH脫氫酶防止了再灌注時(shí)ROS的爆發(fā)。我們的工作進(jìn)一步表明，NADH脫氫酶是一種潛在的效應(yīng)子，可以通過(guò)調(diào)節(jié)其來(lái)防止RET驅(qū)動(dòng)的ROS的產(chǎn)生。

在長(zhǎng)時(shí)間的局部缺血中，由于氧氣有限，復(fù)合體I轉(zhuǎn)變?yōu)槭Щ顮顟B(tài)。與活性形式相比，復(fù)合體I的失活構(gòu)象表現(xiàn)出較低的催化活性，失去了催化RET的能力。再灌注后，復(fù)合體I迅速重新活化以進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致過(guò)多的ROS生成。從理論上講，以失活形式暫時(shí)鎖定復(fù)合體I可作為一種保護(hù)機(jī)制，以限制ROS的產(chǎn)生。為支持該理論，有人提出利用二甲雙胍使復(fù)合體I處于失活狀態(tài)來(lái)保護(hù)心臟免遭缺血性損傷。位于ND3亞基親水環(huán)中的Cys-39的暴露是復(fù)合體I失活形式的分子特征。Cys-39的可逆翻譯后修飾是一種治療性干預(yù)措施，用于以失活形式捕獲復(fù)合體I。在本研究中，人參皂苷Rb1在再灌注的早期階段持續(xù)暴露了被硫醇特異性試劑標(biāo)記的ND3亞基，表明其將復(fù)合體I鎖定在低活性狀態(tài)的潛在能力。進(jìn)一步的分子對(duì)接分析表明，人參皂苷Rb1通過(guò)在三個(gè)氨基酸殘基（包括Cys-39）處的氫鍵與ND3的親水環(huán)相互作用。SPR分析進(jìn)一步表明人參皂苷Rb1可以高親和力結(jié)合ND3亞基。這些結(jié)果表明人參皂苷Rb1可能通過(guò)結(jié)合ND3亞基而以其失活構(gòu)象捕獲線粒體復(fù)合體I，但是，需要進(jìn)一步研究來(lái)闡明人參皂苷Rb1作用于線粒體復(fù)合體I的具體分子機(jī)制。不過(guò)，我們的結(jié)果表明人參皂苷Rb1作用于NADH脫氫酶活性的潛在機(jī)制可能源于其對(duì)活性/去活性的調(diào)控。

哺乳動(dòng)物成年心肌細(xì)胞是終末分化的，因此，成年心臟在心肌細(xì)胞喪失后不能再生，這主要是由于出生后心肌細(xì)胞周期停滯所致。因此，在人參皂甙Rb1治療的小鼠腦缺血后，我們觀察到的梗死面積縮小應(yīng)該是其對(duì)再灌注損傷的最初保護(hù)作用的持久結(jié)果。心肌梗死后，重構(gòu)過(guò)程最初作為一種代償調(diào)節(jié)對(duì)心臟起到保護(hù)作用；然而，由于心肌僵硬，不受控制的纖維化反應(yīng)會(huì)損害心臟功能。由于梗死心臟是纖維化的，我們檢測(cè)了人參皂苷Rb1在缺血后的長(zhǎng)期效應(yīng)，并證實(shí)了它對(duì)心肌纖維化的抑制作用。這表明，限制再灌注損傷對(duì)于恢復(fù)期的功能改善很重要，但需要注意的是，恢復(fù)期觀察到的心功能改善是多方面調(diào)節(jié)的最終結(jié)果?？紤]線粒體功能的全面研究對(duì)于全面評(píng)估潛在的影響是必要的，因此，我們不能肯定地說(shuō)，對(duì)抗再灌注損傷是觀察到的心功能改善的唯一原因。雖然缺血只提供了一個(gè)狹窄的時(shí)間窗口來(lái)減少心臟損害，但我們的工作強(qiáng)調(diào)了及時(shí)的治療干預(yù)對(duì)于改善預(yù)后至關(guān)重要。

總之，人參皂苷Rb1通過(guò)降低NADH脫氫酶活性并將線粒體復(fù)合體I鎖定在失活狀態(tài)，從而適度和可逆地抑制線粒體復(fù)合體I，有助于減輕心肌再灌注損傷。這些發(fā)現(xiàn)不僅為人參皂苷Rb1保護(hù)心臟免受缺血性損傷的機(jī)理提供了新穎的見(jiàn)解，而且還表明，調(diào)節(jié)復(fù)合體I中的NADH脫氫酶活性可能是限制再灌注誘導(dǎo)的線粒體ROS產(chǎn)生的潛在干預(yù)措施。