1. 人類樣本

從美國馬里蘭州Biomax(HLiv-HCC180Sur-03)獲得包含90對人HCC組織和鄰近正常肝組織的組織塊，以及包括2.3~7年隨訪時間的生存數(shù)據(jù)。組織收集來自于2010年1月至2011年9月期間進行手術(shù)的患者。

2. 動物實驗

采用美國Charles River實驗室(MA)的Balb/Cann-nu小鼠建立原位肝癌模型，如前所述，所有小鼠維持12小時光照和12小時黑暗周期，每周測量體重并記錄，C57BL/6J小鼠由美國Jackson實驗室提供，四周齡的C57BL/6J小鼠喂以膽堿缺乏、L-氨基酸定義(CDAA)的飲食(美國賓夕法尼亞州DyetsInc.)，并進行腹腔注射，每周注射兩次四氯化碳。所有小鼠均飼養(yǎng)在香港大學(xué)無病原體實驗動物室。在此詳述的動物程序和輔助方法已通過香港大學(xué)活體動物教學(xué)及研究委員會批準。

1. LOXL4在肝癌發(fā)生過程中呈高表達

我們及其他研究均表明，CDAA飲食誘導(dǎo)的嚙齒動物肝腫瘤可以準確地模擬人類肝臟的癌變過程，CCl4可通過促進肝臟炎癥、纖維化和肝細胞膨脹來促進肝癌的發(fā)生。在本研究中，我們利用CDAA+CCL4誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠肝癌模型檢測了LOXL4的表達，并以CSAA飲食喂養(yǎng)的嚙齒動物作為對照。接受CDAA+CCL4治療的小鼠肝臟在1-3個月時出現(xiàn)廣泛的脂肪變性，6個月時發(fā)展為肝硬化，6-9個月時發(fā)展為肝腫瘤，這一模式在我們的研究中一直被觀察到。隨后在喂養(yǎng)CDAA飲食3個月、6個月和9個月的小鼠中檢測不同類型免疫細胞的浸潤情況。CD45+白細胞浸潤在肝癌發(fā)生的非腫瘤性階段的前6個月明顯增加，反映了人肝癌早期肝臟持續(xù)的慢性炎癥。有趣的是，白細胞浸潤在腫瘤形成階段變得不那么明顯，這表明肝臟微環(huán)境發(fā)生了變化，導(dǎo)致了肝臟免疫微環(huán)境的變化。然而，在肝癌發(fā)生過程中，F(xiàn)4/80+巨噬細胞、CD11c+樹突狀細胞和CD3+T淋巴細胞亞群持續(xù)增加(圖1A)，然而，F(xiàn)4/80+TIM-4+Kupffer細胞亞群在9個月時減少，提示腫瘤發(fā)生時駐留巨噬細胞已耗盡。為了確定LOXL蛋白在肝癌發(fā)生過程中的作用，我們首先研究了LOXL蛋白在肝癌組織和鄰近肝組織中的表達。我們發(fā)現(xiàn)，在HCC組織中觀察到LOXL4的表達顯著增加，并與肝癌患者的低存活率相關(guān)(圖2)，但沒有發(fā)現(xiàn)LOXL1-3的表達。在肝癌變的嚙齒動物模型中，LOXL1和LOXL3的mRNA水平在炎癥階段升高，在腫瘤發(fā)生階段下降，而LOXL4的mRNA水平在腫瘤發(fā)生階段顯著升高(圖1B)，在嚙齒動物模型中未檢測到LOXL2。此外，在接受CSAA治療的小鼠肝臟中，LOXL4的表達沒有發(fā)現(xiàn)明顯的時間變化，這表明LOXL4的上調(diào)是一種與發(fā)病相關(guān)的現(xiàn)象，可能與衰老無關(guān)。在肝癌變的嚙齒動物模型中，9個月發(fā)生腫瘤的小鼠肝臟中LOXL4蛋白的表達顯著高于6個月未發(fā)生腫瘤的小鼠，進一步支持了LOXL4可能參與形成致癌肝臟微環(huán)境的假設(shè)(圖1C)。免疫熒光染色顯示LOXL4蛋白與小鼠巨噬細胞的特異性標志物F4/80大量共存，但不與代表其他免疫細胞的細胞表面標志物共存(圖1D)。這些觀察表明，LOXL4參與了肝癌發(fā)生過程中巨噬細胞的形成。

圖1 肝細胞癌變過程中巨噬細胞表達LOXL4

(A)肝癌發(fā)生過程中免疫細胞的瘤內(nèi)情況。CDAA飲食喂養(yǎng)3、6或9個月的小鼠(每組10只)CD45+、CD45+、F4/80+巨噬細胞、Gr1+粒細胞、CD11c+樹突狀細胞、CD3+T淋巴細胞和CD19+B淋巴細胞(占肝白細胞的百分比)的定量。(B)3、6和9月齡CDAA或CSAA飲食小鼠肝臟中LOXL1、3和4的表達水平。(C)3、6、9月齡CDAA或CSAA喂養(yǎng)小鼠的LOXL4蛋白表達。(D)9月齡CDAA飲食小鼠F4/80+巨噬細胞、CD3+T淋巴細胞、CD20+B淋巴細胞、CD103+樹突狀細胞、CD31+內(nèi)皮細胞和SMA+成纖維細胞中LOXL4共染色。（E）用模擬和LOXL4敲低的Hepa 1-6細胞衍生的外泌體體外處理的BMDM中LOXL4的蛋白表達。（F）HCC組織（n = 360）中LOXL4的mRNA表達與其拷貝數(shù)呈正相關(guān)（r = 0.21，P = 6.591e-5，Spearman秩相關(guān)檢驗），但與DNA甲基化狀態(tài)呈負相關(guān)（r = -0.46，P = 2.28e-20）。*P<.05；**P<.01；*P<.001；N.S.，無統(tǒng)計學(xué)意義；DC，樹突狀細胞；BMDM，骨髓源性巨噬細胞；KD，基因敲除。

已有多條證據(jù)表明LOXL4可能在人肝癌中起致癌作用。為了進一步確定其作用及調(diào)控機制，我們比較了LOXL4在致瘤小鼠的mRNA表達，與其蛋白定位相反，LOXL4mRNA在F4/80+腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)中未檢測到，但在F4/80-肝實質(zhì)細胞中高表達，而來自腫瘤和非腫瘤區(qū)域的F4/80+ACC巨噬細胞中LOXL4的表達變化不大。另外，觀察到BMDMs表達微量的LOXL4mRNA，而在小鼠肝細胞和肝癌細胞系HEPA1-6中檢測到更高水平的LOXL4mRNA，進一步證明了這一結(jié)論。鑒于先前的一項研究報道肝癌細胞可能分泌攜帶LOXL4的外切體，我們得出假設(shè)，腫瘤細胞衍生的外切體被巨噬細胞內(nèi)化，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)LOXL4水平的增加。事實上，在來自HEPA 1-6細胞的外切體中觀察到LOXL4蛋白，并可被BMDM吸收，但沒有觀察到mRNA。表明HEPA1-6細胞來源的外切體的內(nèi)化增加了BMDM中的LOXL4蛋白水平，而來自LOXL4基因敲除的HEPA 1-6細胞的外切體的內(nèi)化導(dǎo)致了BMDM中LOXL4蛋白水平的降低(圖1E)。然后，我們探討了導(dǎo)致肝細胞癌中LOXL4過表達的可能機制，通過從腫瘤基因組圖譜(TCGA)檢索數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)肝癌組織中LOXL4mRNA的表達與拷貝數(shù)呈正相關(guān)，此外，LOXL4的mRNA水平與其DNA甲基化狀態(tài)呈負相關(guān)（圖1F），DNA去甲基化試劑5-氮雜胞苷可顯著誘導(dǎo)肝癌細胞LOXL4mRNA表達?？傊?，這些觀察表明肝癌的發(fā)生過程涉及腫瘤細胞通過表觀遺傳調(diào)節(jié)LOXL4的過度表達。

2. 肝臟中LOXL4的促腫瘤作用需要巨噬細胞的參與

為了研究LOXL4的作用，我們使用腺病毒(AAV)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)有條件地敲除LOXL4在原位小鼠肝癌模型中的表達，由AAV8遞送的針對LOXL4靶標的shRNA可特異性地沉默LOXL4在小鼠肝臟中的表達(圖2A)。與先前的研究一致，肝LOXL4敲除的小鼠表現(xiàn)出每周腫瘤生長減慢，肝臟腫瘤體積和微血管密度減少(圖2A)，與AAV8干擾shRNA處理的陰性對照小鼠相比，在LOXL4基因敲除的小鼠中，CD11b+F4/80+TAMS群體的肝臟浸潤明顯減少(圖2B)。肝癌細胞中LOXL4的沉默在體外顯示出，細胞存活及增殖減少，而在長期培養(yǎng)中沒有生長差異。盡管如此，補充rLOXL4對肝癌細胞的增殖和存活的影響微乎其微，提示肝癌細胞內(nèi)過表達LOXL4支持細胞增殖，而分泌型LOXL4可能作用于腫瘤微環(huán)境。 

為了證實這一點，我們將rLOXL4腹膜內(nèi)注射到小鼠肝癌的原位模型中（支持圖S5A）。鼠rLOXL4的注射增加了TAM中LOXL4的蛋白水平，并導(dǎo)致肝臟中原位腫瘤的加速生長（圖2C），而小鼠的食物攝入量和體重卻保持不變（支持圖S5A）。此外，rLOXL4注射顯著增加了肝微環(huán)境中CD11b + F4 / 80 + TAM的數(shù)量（圖2D），其中，TAM的擴增是由單核細胞浸潤或局部增殖引起的。隨后，我們在腹膜內(nèi)注射了PKH26染色的骨髓單核細胞，發(fā)現(xiàn)rLOXL4注射有效增加了TAM的PKH26+群體，而BrdU染色顯示由LOXL4誘導(dǎo)的駐留巨噬細胞增殖極小（圖2E）。這些數(shù)據(jù)表明LOXL4誘導(dǎo)的TAM升高主要歸因于單核細胞浸潤。

圖2 LOXL4通過增加TAMS浸潤促進肝癌生長

(A)AAV8-shSrc或shLOXL4干預(yù)(每組8只)小鼠的肉眼腫瘤生長和肝/體重比(%)。(B)原位荷瘤小鼠CD11b+、F4/80+巨噬細胞(占腫瘤浸潤白細胞的百分比)的定量。(C)(i)注射賦形劑或rLOXL4對原位小鼠肝臟LOXL4蛋白表達的影響。(ii)接受賦形劑或rLOXL4注射的原位肝癌免疫耐受和免疫活性小鼠的肉眼腫瘤生長情況，腫瘤直徑和肝臟/體重比(%)的量化顯示在右側(cè)。(D)原位荷瘤小鼠(n=10)CD11b+、F4/80+巨噬細胞(占腫瘤浸潤白細胞的百分比)的定量。(E)用PKH26和BrdU標記，流式細胞儀檢測TAMs的浸潤(i)和局部增殖(ii)。*P<.05；**P<.01；N.S.，無統(tǒng)計學(xué)意義。

為了進一步了解LOXL4在調(diào)節(jié)巨噬細胞中的作用，我們在體外成熟過程中用rLOXL4補充了BMDM，發(fā)現(xiàn)rLOXL4補充在BMDM成熟的早期顯著增加了F4 / 80 +種群；然而，這種作用在后期變得不那么明顯，表明LOXL4可能加速了巨噬細胞的成熟。此外，rLOXL4的補充有效誘導(dǎo)了MCP-1的表達，從而導(dǎo)致BMDM的運動性增強。為了證實巨噬細胞的參與，我們將氯膦酸脂質(zhì)體用于消除原位肝腫瘤小鼠的TAM，不管rLOXL4處理如何，注射脂質(zhì)體氯膦酸鹽都能成功清除患有肝腫瘤的小鼠的TAM，顯示rLOXL4促進腫瘤生長的作用微不足道（圖3A）。由于LOXL4在HCC細胞中的內(nèi)源表達直接誘導(dǎo)細胞增殖，因此我們將rLOXL處理的BMDM進行過繼轉(zhuǎn)移至LOXL4消融的荷瘤小鼠中，以證實LOXL4誘導(dǎo)的巨噬細胞對HCC生長的作用，與過繼物處理的BMDM相比，rLOXL4處理的BMDM的轉(zhuǎn)移顯著加速了肝臟原位腫瘤的生長，這表明LOXL4在調(diào)節(jié)體內(nèi)HCC生長中，在巨噬細胞中的調(diào)節(jié)起主要作用。這些發(fā)現(xiàn)表明LOXL4在肝癌中的致癌作用需要巨噬細胞的存在和調(diào)節(jié)。

3. LOXL4塑造巨噬細胞的免疫抑制表型

一項研究假設(shè)顯示，募集巨噬細胞產(chǎn)生促炎因子進而促進轉(zhuǎn)化的上皮細胞的生長，這些被激活的巨噬細胞本應(yīng)殺死異常細胞，在腫瘤微環(huán)境中可被重新分化為具有促進腫瘤的M2表型的細胞，然而，我們觀察到在rLOXL4處理的巨噬細胞中M2型巨噬細胞標記CD206的表達沒有顯著變化，這一結(jié)果進一步得到了M2細胞因子如白細胞介素10和轉(zhuǎn)化生長因子β的未改變的表達的支持。有趣的是，我們隨后觀察到rLOXL4處理基本上維持了分化的BMDM上的Ly6C細胞表面的標記(圖3B)。由于先前的一項研究表明高水平表達Ly6C的巨噬細胞表現(xiàn)出免疫抑制特性，我們從rLOXL4處理的BMDM中分離出Ly6C+和Ly6C-群體，rLOXL4可促進Ly6C-和Ly6C+巨噬細胞免疫抑制基因的表達，且在Ly6C+細胞中的作用更為顯著(圖3C)。另外，觀察到rLOXL4處理的巨噬細胞與CD8+T細胞共培養(yǎng)時，可顯著降低T細胞增殖，進一步支持了rLOXL4處理的巨噬細胞的免疫抑制特性。顆粒酶B和Ki-67的細胞內(nèi)染色，是激活的細胞毒性T細胞的一個特征，顯示與rLOXL4處理的巨噬細胞共培養(yǎng)阻止了細胞毒性T細胞的激活(圖3D)。同樣，從rLOXL4治療的原位肝腫瘤小鼠中分離出的TAMS對T細胞的增殖和激活顯示出顯著的抑制作用(圖3E)。表明rLOXL4單獨對細胞毒性T細胞的直接激活作用最小。

圖3 LOXL4促進巨噬細胞對CD8+細胞毒T細胞的免疫抑制作用

(A)克羅膦酸鹽脂質(zhì)體干預(yù)對照組和rLOXL4處理組小鼠肝腫瘤的熒光素酶強度信號。對照組和rLOXL4治療組小鼠(每組8只)的宏觀腫瘤生長和肝/體重比(%)與氯膦酸鹽脂質(zhì)體干預(yù)組小鼠的腫瘤生長和肝/體重比(%)有關(guān)?？肆_膦酸鹽脂質(zhì)體干預(yù)下對照組和rLOXL4處理組小鼠肝臟中CD11b+F4/80+巨噬細胞(占腫瘤浸潤白細胞的百分比)的定量。(B)用rLOXL4(100 NM)處理培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細胞24h，用載體或rLOXL4對CD11b+F4/80+骨髓基質(zhì)細胞進行Ly6C表達的定量檢測，并用流式細胞儀檢測Ly6C在CD11b+F4/80+骨髓基質(zhì)細胞中的表達。(C)檢測FACS分選的Ly6C-和Ly6C+BMDM中iNOS和STAB1mRNA的表達水平。(D)CFSE標記的顆粒酶B+或Ki-67+脾臟CD8+T細胞(經(jīng)抗CD3/CD28抗體刺激)與載體或rLOXL4處理的BMDM共培養(yǎng)的代表性直方圖。陽性細胞的百分比顯示在右側(cè)面板中。(E)與FACS分選的TAMs共培養(yǎng)的CD8+、CD8+顆粒酶B+和CD8+Ki-67+T細胞的數(shù)量測定(CFSE標記的CD8+、CD8+顆粒酶B+和CD8+Ki-67+T細胞與FACS分選的TAMs共培養(yǎng))。*P<.05；**P<.01；*P<.001；N.S.，無統(tǒng)計學(xué)意義；Lip.，克羅膦酸鹽脂質(zhì)體。

T細胞的激活需要L-精氨酸，它由巨噬細胞中的精氨酸酶-1和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(INOS)代謝，我們觀察到rLOXL4對巨噬細胞中精氨酸酶-1的表達影響很小，但顯著增加了巨噬細胞中的iNOS的表達。然而，補充L-精氨酸或抑制iNOS都不能恢復(fù)T細胞的增殖，或細胞內(nèi)Ki-67和顆粒酶B的表達，提示LOXL4對免疫抑制巨噬細胞的調(diào)節(jié)機制不依賴于精氨酸。

4. PD-L1介導(dǎo)LOXL4誘導(dǎo)的巨噬細胞免疫抑制

巨噬細胞通過不依賴L-精氨酸的多種機制促進腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制。巨噬細胞通過PD-L1/PD-L2和CD86/CD80等細胞抗原與殺瘤T細胞相互作用，使T細胞活化，導(dǎo)致功能衰竭。因此，我們研究了LOXL4是否參與了肝癌生長過程中巨噬細胞的免疫檢查點調(diào)節(jié)，在體外，rLOXL4可顯著誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細胞中PD-L1和CD86的表達，而不是PD-L2或CD80的表達(圖4A)，此外，rLOXL4誘導(dǎo)巨噬細胞PD-L1和CD86的作用具有劑量依賴性。有趣的是，補充rLOXL4或耗盡LOXL4都不能誘導(dǎo)肝腫瘤細胞中PD-L1和CD86的表達，提示LOXL4的作用是巨噬細胞所特有的。用rLOXL4處理BMDM顯著增加PD-L1mRNA的表達(圖4B)，表明LOXL4在轉(zhuǎn)錄上激活了PD-L1，用中和抗體阻斷rLOXL4處理的巨噬細胞中的PD-L1，顯示恢復(fù)了共培養(yǎng)的T細胞的增殖和激活(圖4C)。為了確定PD-L1是否介導(dǎo)了體內(nèi)免疫抑制和致瘤效應(yīng)，我們使用抗PD-L1中和抗體來阻斷TAM表達的PD-L1在原位肝腫瘤小鼠中的表達。我們過繼轉(zhuǎn)移脾臟T細胞以重建荷瘤裸鼠的免疫微環(huán)境，我們發(fā)現(xiàn)過繼轉(zhuǎn)移72h后，羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標記的T細胞回到原位腫瘤中，rLOXL4治療降低了小鼠肝腫瘤中CD3+T細胞的數(shù)量(圖4D)，并減弱了過繼T細胞轉(zhuǎn)移的殺瘤作用，此外，抗PD-L1中和抗體顯著恢復(fù)了T細胞相關(guān)腫瘤的消退(圖4E)?？偠灾?，這些發(fā)現(xiàn)表明LOXL4對TAMS的免疫抑制作用需要PD-L1呈遞。

圖4 經(jīng)LOXL4處理的巨噬細胞對細胞毒性T細胞的免疫抑制作用依賴于PD-L1

(A)用賦形劑或rLOXL4處理后，檢測具有代表性的BMDMs的PD-L1、PD-L2、CD80和CD86的表達。F4/80+細胞中該表達的量化顯示在右側(cè)。(B)檢測賦形劑和rLOXL4對骨髓基質(zhì)細胞PD-L1mRNA表達水平的影響。(C)CFSE標記的脾臟CD8+、CD8+顆粒酶B+和CD8+Ki-67+T細胞與rLOXL4處理的骨髓基質(zhì)細胞(加或不加PD-L1中和抗體)共培養(yǎng)。(D)過繼轉(zhuǎn)移T細胞小鼠肝臟中CD3+T細胞的定量。(E)來自(i)載體或rLOXL4免疫耐受，以及過繼T轉(zhuǎn)移后經(jīng)或不經(jīng)PD-L1抗PD-L1治療的rLOXL4治療小鼠的典型肝臟腫瘤，以及(ii)經(jīng)Vehicle或rLOXL4加或不加抗PD-L1治療的具有免疫能力的小鼠。腫瘤直徑和肝臟與體重的比率(%)如右圖所示。*P<0.05；**P<0.01；N.S.，無統(tǒng)計學(xué)意義。

為了解LOXL4對巨噬細胞PD-L1表達的調(diào)控機制，我們采用無標記蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了rLOXL4對骨髓基質(zhì)細胞內(nèi)蛋白表達的影響。蛋白表達分析顯示STAT1、STAT2、STAT3等STATs表達上調(diào)，然而，免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，rLOXL4誘導(dǎo)了STAT1和STAT3的激活，而STAT2在BMDM中幾乎檢測不到(圖5A)。先前的一項研究觀察到，STAT1-STAT3的異源二聚體可能作為轉(zhuǎn)錄因子促進含有IRE-啟動子元件的表達，這些元件大多是免疫抑制的，通過藥物抑制阻斷STAT3或STAT1導(dǎo)致rLOXL4處理的BMDM中PD-L1的表達和轉(zhuǎn)錄激活減少(圖5B)。此外，rLOXL4處理的巨噬細胞中STATS介導(dǎo)的PD-L1表達的失活取消了其對共培養(yǎng)的細胞毒性T細胞增殖和激活的抑制作用(圖5C)。此外，基因集富集分析(GSEA)顯示，與干擾素(IFNs)相關(guān)信號通路相關(guān)的基因受到LOXL4的正調(diào)控，大多數(shù)與干擾素相關(guān)信號傳遞相關(guān)的基因都受到rLOXL4暴露的巨噬細胞的顯著調(diào)控(圖5D)。隨后，進一步的驗證證實了在rLOXL4處理的BMDM中I型干擾素刺激的基因，如ISG15，CCL5和ICAM1的增加，IFNAR中和抗體阻斷I型干擾素相關(guān)信號可降低rLOXL4誘導(dǎo)的STAT3和STAT1活化(圖5E)，以及I型干擾素刺激基因的表達。因此，rLOXL4誘導(dǎo)的PD-L1表達增加和轉(zhuǎn)錄激活也被IFNAR中和抗體減弱(圖5F)。

圖5 LOXL4通過IFN依賴的STAT1、STAT3信號介導(dǎo)PD-L1反式激活

(A)對載體和LOXL4處理的BMDM進行無標記蛋白質(zhì)組分析，觀察載體劑和LOXL4處理的BMDM中STAT1、2和3折疊蛋白表達的變化。免疫印跡分析證實了rLOXL4處理的BMDM中STAT1和STAT3的蛋白表達。(B)在(i)STATTIC或(ii)氟達拉濱存在的情況下，用rLOXL4處理BMDM，觀察PD-L1表達的代表性直方圖。右側(cè)顯示了在F4/80+細胞中的定量表達，以及在Stattic(5μM)或氟達拉濱(10μM)存在下PD-L1mRNA的表達。(C)CFSE標記的脾臟CD8+、CD8+Ki-67+和CD8+顆粒酶B+T細胞與rLOXL4處理的STAT3沉默的BMDM共培養(yǎng)后定量。(D)(i)骨髓基質(zhì)細胞中rLOXL4調(diào)節(jié)基因集的富集分數(shù)。(ii)載體和rLOXL4處理的BMDM之間差異表達的IFN信號相關(guān)基因的熱圖。(E)免疫印跡法檢測IFNAR1中和抗體對BMDM中STAT3和STAT1蛋白表達的影響。(F)在抗IFNAR1(50μg/ml)存在下，定量檢測rLOXL4處理的BMDM中PD-L1的表達和mRNA水平。*p<.05；**p<.01；*p<.001；siSTAT3.，STAT3沉默。

LOXL4催化胺基團的轉(zhuǎn)化，并以銅依賴的方式生成過氧化氫(H2O2)和副產(chǎn)物氨。LOXL4干預(yù)以時間依賴的方式顯著增加BMDM中H2O2的水平(圖6A)，用銅螯合劑四硫鉬酸(TTM)處理后，rLOXL4處理的BMDM中H2O2的產(chǎn)生被阻斷(圖6B)，提示LOXL4增加H2O2需要銅介導(dǎo)的酶促反應(yīng)，巨噬細胞中H2O2相關(guān)的氧化還原失衡可能誘導(dǎo)免疫抑制表型的表達，BMDMs與H2O2直接孵育可顯著誘導(dǎo)PD-L1的表達(圖6C)，而阻斷rLOXL4處理的BMDM中的H2O2則抑制PD-L1的誘導(dǎo)(圖6D)。在H2O2清除時，LOXL4對STATS的激活也被阻斷(圖6D)，提示LOXL4誘導(dǎo)的H2O2激活了IFN相關(guān)STATS介導(dǎo)的PD-L1，TTM與銅的螯合作用一致地降低了STAT3和STAT1的激活，以及rLOXL4誘導(dǎo)的PD-L1表達的降低(圖6E)。有趣的是，我們觀察到LOXL4增加了肝癌細胞中H2O2的水平，但增加的H2O2并沒有改變肝癌細胞中STAT1/3的表達(圖6F)，提示LOXL4介導(dǎo)的PD-L1表達具有細胞類型特異性，這些觀察表明，銅依賴的H2O2的產(chǎn)生是激活干擾素相關(guān)的STATS介導(dǎo)的PD-L1在LOXL4處理的巨噬細胞中的原因。

圖6 銅依賴的H2O2產(chǎn)生調(diào)節(jié)LOXL4介導(dǎo)的STATS介導(dǎo)的PD-L1的表達

(A)使用Amplex Red過氧化氫檢測試劑盒對經(jīng)載體和rLOXL4處理的BMDM進行H2O2測定。(i)以紅色熒光間苯二酚的平均熒光強度為指標；(ii)測定不同孵育時間內(nèi)H2O2的產(chǎn)生量。(B)在TTM存在的情況下用rLOXL4處理骨髓基質(zhì)細胞后的H2O2水平。(C)用0.125 mM H2O2處理骨髓基質(zhì)細胞后，觀察PD-L1表達的代表性直方圖。F4/80+細胞中該表達的量化顯示在右側(cè)。(D)(i)H2O2水平；(ii)PD-L1表達和(iii)rLOXL4在過氧化氫酶(500U/ml)或NAC存在下處理BMDM后STAT1和STAT3的蛋白表達；(E)rLOXL4在TTM存在的情況下處理HEPA1-6細胞。(F)(i)平均產(chǎn)生H2O2和(ii)用賦形劑或rLOXL4處理的HEPA1-6細胞中STAT1和STAT3的蛋白表達。*p<.05；**p<.01；*p<.001；MFI，平均熒光強度；NAC，N-乙酰半胱氨酸；TTM，四硫代鉬酸根。

5. LOXL4加速肝臟腫瘤形成

我們推測LOXL4通過STAT1-STAT3介導(dǎo)的PD-L1活化來觸發(fā)巨噬細胞的免疫抑制功能，并預(yù)期這一作用促進了肝癌的發(fā)生過程。然后，我們在CDAA飲食喂養(yǎng)的嚙齒動物肝臟腫瘤發(fā)生模型中使用了CCl4，在肝硬化開始時(7個月)和腫瘤形成后(9個月)補充rLOXL4，顯示rLOXL4處理顯著增加了肝臟中的LOXL4水平(圖7A)，值得注意的是，當從第7個月開始連續(xù)服用rLOXL4 3個月時，補充rLOXL4加速了腫瘤的形成，這種加速也反映在腫瘤大小、腫瘤病變頻率和肝臟/體重比的增加上(圖7B)。然而，當rLOXL4在顯著的腫瘤形成后(9個月)給藥時，其效果就不那么明顯了，盡管這種模式不能排除相對短期的rLOXL4治療產(chǎn)生效果的可能性。組織學(xué)分析表明，rLOXL4治療有效地加速了肝臟的腫瘤性轉(zhuǎn)化，其特征包括實體瘤形成、細胞質(zhì)內(nèi)含物和小梁形態(tài)(圖7C)，以及增加致癌的Glypican-3+、增殖的Ki-67+和CD31+CD105+的微血管細胞(圖7D)，這種轉(zhuǎn)化伴隨著rLOXL4處理的小鼠肝臟中TAMS浸潤的增加和CD8+細胞毒性T細胞的減少(圖7E)，而CD4+T細胞沒有明顯變化。同樣，我們在rLOXL4處理的小鼠的肝臟中觀察到PD-L1和AFP的有效過表達(圖7F)。這些發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)地揭示了LOXL4是促進肝癌發(fā)生的一個重要因素。  

圖7 LOXL4促進CDAA+CCl4處理小鼠肝癌的發(fā)生

(A)C57BL/6J小鼠在喂飼CDAA飼料的同時注射CCl4，然后從7個月或9個月開始給予rLOXL4治療。用rLOXL4處理CDAA飼料喂養(yǎng)1個月或3個月的小鼠，檢測肝臟LOXL4蛋白的表達。(B)用rLOXL4治療1個月或3個月的CDAA飲食喂養(yǎng)小鼠的典型肉眼腫瘤、最大腫瘤大小、表面結(jié)節(jié)數(shù)和肝/體重比(%)。(C)CDAA飼料喂養(yǎng)小鼠的H&E染色分析和生長模式。(D)免疫熒光法檢測肝組織中Glypican-3、Ki-67、CD31和CD105的表達水平。(E)用rLOXL4處理1個月或3個月的CDAA飲食喂養(yǎng)的小鼠，測定CD11b+F4/80+巨噬細胞和CD3+CD4+或CD8+T細胞(占腫瘤浸潤白細胞的百分比)(n=10)。(F)免疫熒光法檢測肝組織(i)PD-L1和(ii)AFP的表達水平。*P<.05；**P<.01；*P<.001。

6. 肝細胞癌中LOXL4表達上調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)

為了確定LOXL4是否與HCC的免疫狀況和臨床結(jié)果相關(guān)，我們通過評估包含90名患者切片的組織陣列，比較了LOXL4在肝癌組織和鄰近非腫瘤組織中的表達（圖8A），觀察到LOXL4在腫瘤中的表達顯著增加。大約70%的LOXL4+細胞是CD68+TAMs(67.87%±12.03%)，肝癌組織中LOXL4+CD68+細胞明顯高于LOXL4+CD68-細胞(圖8B)，提示LOXL4主要在HCC的TAM中表達。在CD68+TAMS中，TAMS特異性LOXL4的表達與PD-L1水平呈正相關(guān)(圖8B)。為了確定LOXL4是否與肝細胞癌(HCC)的免疫狀況和臨床預(yù)后相關(guān)，我們評估了LOXL4的表達與患者生存的相關(guān)性，CD68+TAMs中LOXL4和PD-L1的聯(lián)合表達預(yù)測肝癌患者的生存，肝癌CD68+細胞中攜帶LOXL4lo 、PD-L1lo的患者總體生存率高于攜帶LOXL4hi、PD-L1hi的患者(圖8C)。同樣，CD68+細胞中CD8Ahi和TAMS特異性LOXL4lo比CD8Alo和TAMS特異性LOXL4hi預(yù)測HCC患者更好的生存(圖8C)，提示LOXL4介導(dǎo)的巨噬細胞可能影響CD8+T細胞的功能和HCC的臨床轉(zhuǎn)歸，雖然LOXL4在CD68+TAMs中的表達在不同分期的HCC患者隊列中沒有顯著差異，但在不同分期的HCC患者中，LOXL4的表達沒有明顯差異(圖8D)。進一步亞組分析顯示，有肝硬化病史的HCC患者CD68+TAMs中LOXL4的表達高于非肝硬化患者(圖8E)。另外，包括LOXL4在內(nèi)的LOX家族蛋白已被報道以銅依賴的方式催化細胞外基質(zhì)成分的交聯(lián)，這通過延緩基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)的蛋白水解降解促進了纖維化的形成，肝硬化和非肝硬化患者之間LOXL4表達的差異導(dǎo)致我們根據(jù)病毒性肝炎狀況確定患者的亞組。在HBV陽性患者的肝癌組織中，LOXL4顯著過表達，此外，HBV感染的患者顯示肝臟LOXL4表達增加。盡管如此，病毒載量類型對LOXL4的表達沒有顯著影響，因為有HBV或HCV背景的HCC患者都高表達LOXL4，這些數(shù)據(jù)表明，肝LOXL4的表達是慢性肝炎患者肝細胞癌的共同特征。因此，肝細胞癌中LOXL4的高表達可能意味著免疫抑制的微環(huán)境以及令人沮喪的臨床結(jié)果。

圖8 肝細胞癌中LOXL4表達上調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)

(A)具有代表性的人肝癌組織和相應(yīng)鄰近健康肝組織的免疫熒光圖像，顯示LOXL4、PD-L1、CD68和CD8A的表達。(B)LOXL4在(i)CD68+和CD68-細胞中的相對表達，(ii)非腫瘤組織和HCC組織中CD68+細胞的相對表達，(iii)LoxL4在CD68+細胞中的表達(n=83)與其PD-L1水平呈正相關(guān)(r=0.2943，P<0.0001)。然后，我們檢索了該隊列中HCC患者的生存數(shù)據(jù)，(C)(i)CD68+TAM中攜帶LOXL4loPD-L1lo的肝癌患者較CD68+TAMs中攜帶LOXL4hiPD-L1hi的患者生存率高；(ii)腫瘤組織中TAMS特異性LOXL4的低表達和CD8A的高表達協(xié)同預(yù)測HCC患者的較好生存。(D)定量檢測不同分期肝癌患者CD68+細胞中LOXL4的表達。(E)不同肝硬化狀態(tài)肝癌患者CD68+細胞中LOXL4表達的定量。(F)LOXL4在肝癌發(fā)生過程中建立免疫抑制微環(huán)境的調(diào)節(jié)機制。*P<.05；*P<.001；N.S.，無統(tǒng)計學(xué)意義；n.a.，不可用。

本研究表明LOXL4及其下游信號級聯(lián)在促進肝腫瘤后續(xù)進展的免疫抑制微環(huán)境中起重要作用，LOXL4的這種作用可能是通過塑造肝臟中的巨噬細胞來實現(xiàn)的，一方面，招募更多的浸潤的巨噬細胞，另一方面，調(diào)節(jié)巨噬細胞呈遞抑制性檢查點分子PD-L1，這反過來又削弱了細胞毒性T細胞介導(dǎo)的免疫監(jiān)視。LOXL4在腫瘤發(fā)展過程中呈進行性增加，主要表達在肝癌的TAMs中，但也定位于其他間質(zhì)細胞，如內(nèi)皮細胞。雖然我們不能排除LOXL4作用于內(nèi)皮細胞的可能性，但對人肝癌組織的進一步分析顯示，大約70%的LOXL4+細胞是CD68+TAMs，提示LOXL4具有潛在的免疫調(diào)節(jié)功能。進一步證實巨噬細胞參與LOXL4介導(dǎo)的肝癌生長的外在效應(yīng)：(i)使用脂質(zhì)體克羅膦酸鹽耗盡巨噬細胞導(dǎo)致LOXL4沒有明顯的促生長作用，(ii)將rLOXL4處理的BMDM轉(zhuǎn)移到LOXL4去除的荷瘤小鼠體內(nèi)，加速了HCC的生長，這進一步證實了巨噬細胞參與了LOXL4介導(dǎo)的肝癌生長的外在效應(yīng)。雖然LOXL4直接支持肝癌細胞的內(nèi)在功能，但我們目前的研究結(jié)果表明，LOXL4通過巨噬細胞調(diào)節(jié)的外在作用可能主導(dǎo)了肝癌的生長和發(fā)展。 

我們的研究提示LOXL4可能參與了腫瘤的發(fā)生過程，并推測外切體LOXL4通過誘導(dǎo)PD-L1遞呈形成免疫抑制的巨噬細胞。LOXL4誘導(dǎo)的巨噬細胞PD-L1表達具有統(tǒng)計依賴性(圖8F)，通過同源二聚化激活STAT1與巨噬細胞的炎癥表型有關(guān)。先前的一項研究報道，誘發(fā)的STAT3介導(dǎo)的免疫抑制和受損的STAT1驅(qū)動的免疫監(jiān)視有助于免疫逃避調(diào)節(jié)PD-L1的表達，我們觀察到STAT1或STAT3的藥物抑制降低了LOXL4對PD-L1的激活。LOXL4可能通過誘導(dǎo)STAT1：STAT3異二聚化來激活PD-L1，事實上，STAT3是PD-L1的轉(zhuǎn)錄因子。EBV感染通過增加單核細胞中STAT3的活性來誘導(dǎo)PD-L1的表達，在抗PD-L1治療期間，阻斷髓系細胞中的STAT3可以增強CD8+T細胞的激活。我們的發(fā)現(xiàn)一致地觀察到，抑制STAT3可以恢復(fù)T細胞的功能，而對STAT1的抑制作用不那么顯著，盡管兩者都降低了PD-L1的激活。STAT1和STAT3如何成比例地介導(dǎo)LOXL4誘導(dǎo)的PD-L1表達尚不清楚，但在激活下游效應(yīng)方面，STAT3/STAT3同源二聚體似乎比STAT1：STAT3異源二聚體更有效。此外，在沒有STAT3的細胞中，STAT1的活性延長，表明STAT3通過負調(diào)控促進了STATS的平衡。

用中和抗體阻斷I型IFN相關(guān)信號，可阻斷STATS激活和LOXL4誘導(dǎo)的PD-L1表達，提示I型IFN受體與LOXL4之間的相互作用是激活免疫抑制信號所必需的。進一步分析表明，LOXL4誘導(dǎo)的H2O2激活I(lǐng)FN相關(guān)STATS介導(dǎo)的PD-L1，而LOXL4誘導(dǎo)的H2O2對巨噬細胞和肝癌細胞的作用不同，提示IFNAR信號的敏感性可能在LOXL4誘導(dǎo)的細胞類型特異性PD-L1中起重要作用。H2O2作為信使分子通過催化相關(guān)蛋白半胱氨酸殘基的翻譯后修飾來調(diào)節(jié)激酶活性，并參與JAK的激活，在晚期肝病和肝細胞癌患者的肝組織中有報道干擾素信號受損。惡性腫瘤切片的患者表現(xiàn)出干擾素信號的抑制，提示在惡性腫瘤過程中干擾素信號被選擇性地關(guān)閉。最近的研究報道肝癌患者攜帶至少一個肝癌特異性的IFNAR-1基因啟動子多態(tài)性，導(dǎo)致肝癌細胞對干擾素β的反應(yīng)不同，這與我們的觀察結(jié)果相呼應(yīng)，即分泌型LOXL4對肝癌細胞生長的作用微乎其微。盡管可能需要進一步的研究來確認I型IFN信號蛋白的修飾狀態(tài)，但我們的發(fā)現(xiàn)支持這樣的說法，即LOXL4對銅依賴的H2O2的產(chǎn)生是I型IFN信號介導(dǎo)的巨噬細胞PD-L1遞送的關(guān)鍵激活劑。

對肝硬化和非肝硬化患者LOXL4表達的分析表明，LOXL4在慢性肝炎肝細胞癌患者中高表達。盡管與其他LOXL蛋白相比，有關(guān)LOXL4在纖維化中的作用的研究報道較少，但在不同病理因素引起的肝纖維化組織中，LOXL4顯著增加，這與我們的觀察結(jié)果一致。肝纖維化過程中LOXL4誘導(dǎo)的確切機制尚不完全清楚，但促纖維化因子可能啟動了LOXL4的轉(zhuǎn)錄，肝纖維化過程中高表達的細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β-1通過激活Smad和AP-1轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)成纖維細胞表達LOXL4，LOXL4的表達與轉(zhuǎn)化生長因子β-1誘導(dǎo)的肝纖維化有關(guān)。炎性因子IL-β1在體外可誘導(dǎo)肝纖維化患者肝組織中LOXL44的表達，不同的促纖維化因子及其在肝纖維化形成過程中的相互作用可能共同促進了肝硬化肝組織中LOXL4的表達。

綜上所述，我們確定了賴氨酰氧化酶蛋白LOXL4在肝癌發(fā)生中的新作用。我們的研究表明，LOXL4在肝癌發(fā)生過程中起著促進免疫抑制微環(huán)境的重要作用。