原名：Gut Microbiota-DerivedShort-Chain Fatty Acids Promote Post-Stroke Recovery in Aged Mice

譯名：腸道菌群衍生的短鏈脂肪酸促進(jìn)老年小鼠的中風(fēng)后恢復(fù)

期刊：Circulation Research

IF：14.467

發(fā)表時(shí)間：2020

通信作者：McCullough, Venugopal R. Venna

通信作者單位：德克薩斯大學(xué)休斯頓健康科學(xué)中心(休斯頓) 麥戈文醫(yī)學(xué)院神經(jīng)病學(xué)系

老年雄性小鼠（18-20個(gè)月）通過(guò)大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）實(shí)驗(yàn)造成缺血性中風(fēng)。在MCAO后3天，使用年輕小鼠腸道菌群（2-3個(gè)月）或老年小鼠的腸道菌群（18-20個(gè)月）進(jìn)行糞菌移植實(shí)驗(yàn)。對(duì)于腸道內(nèi)容物進(jìn)行微生物測(cè)序和代謝組學(xué)研究，同時(shí)使用流式細(xì)胞法測(cè)定相關(guān)細(xì)胞數(shù)，并且測(cè)定大腦、血漿和腸道的SCFAs濃度。

腦與腸間的雙向通訊的研究基礎(chǔ)為中風(fēng)和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究開(kāi)辟了新領(lǐng)域。這種雙向通訊，稱為微生物群-腸-腦（MGB）軸，為腦卒中的預(yù)防和治療提供了新的途徑。腦中風(fēng)后，由MGB軸從大腦到腸道的通訊（自上而下的信號(hào)傳遞）被激活，盡管確切的機(jī)理尚不清楚，但明顯的是中風(fēng)會(huì)改變腸道的蠕動(dòng)，增加腸道的通透性，激活免疫細(xì)胞，并將腸道微生物組轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘愿叩臓顟B(tài)。腸道營(yíng)養(yǎng)不良時(shí)，微生物群通過(guò)MGB軸與大腦溝通（自下而上的信號(hào)），加劇了中風(fēng)的有害作用。這種自下而上的信號(hào)可能涉及到促炎細(xì)胞通過(guò)血液從腸道遷移到大腦。潛在機(jī)制包括源于腸道的細(xì)菌毒素或代謝產(chǎn)物傳入神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，或者通過(guò)破壞的腸道屏障進(jìn)入血液。

在實(shí)驗(yàn)性中風(fēng)發(fā)生之前或之時(shí)，可通過(guò)糞菌移植（FTG）或抗生素改變腸道微生物組，且可顯著影響其恢復(fù)。但是，目前尚不知道抗炎性FTG在當(dāng)中風(fēng)后數(shù)小時(shí)至數(shù)天時(shí)是否能有效發(fā)揮治療效果。如果可有效改變中風(fēng)后腸道微生物組，那么在中風(fēng)時(shí)缺乏健康或抗炎性腸道微生物組的個(gè)體可通過(guò)糞菌移植治療。

短鏈脂肪酸（SCFA）是細(xì)菌代謝腸道中的不易消化的纖維而產(chǎn)生的，SCFAs可通過(guò)激活G蛋白偶聯(lián)受體和抑制組蛋白脫乙?；竵?lái)穩(wěn)定腸道環(huán)境。已證明，糞便SCFAs在老年小鼠中減少約70％。因此，我們檢驗(yàn)了這樣的假設(shè)：我們可以通過(guò)益生菌和益生元恢復(fù)SCFAs的濃度，并改善實(shí)驗(yàn)性卒中后老年小鼠的癥狀。 

老年中風(fēng)小鼠的腸道微生物特征可復(fù)制供體腸道微生物的特征。16S rRNA測(cè)序分析兩個(gè)FTG后的腸道微生物組成。線性判別（LEfSe）分析顯示，年輕和老年供體小鼠之間的腸道菌群組成具有顯著差異。另外，年輕小鼠腸道微生物主要包括放線菌屬的雙歧桿菌科（Bifidobacterium和Bifidobacteriaceae）和梭菌屬的梭菌科（Clostridium和lostridiaceae）。主坐標(biāo)分析（PCoA）發(fā)現(xiàn)移植的受體小鼠微生物組反映了不含抗生素的FTG不會(huì)影響受體小鼠的腸道菌群分布。與用年老的FTG飼養(yǎng)的小鼠相比，用年輕的微生物組定殖的老年中風(fēng)小鼠的擬桿菌和擬桿菌屬的含量較低。中風(fēng)后年輕菌群的恢復(fù)可改善老年小鼠的行為，而與梗死面積無(wú)關(guān)。為了評(píng)估年輕腸道菌群的影響，首先評(píng)估了中風(fēng)后第14天移植了年輕或老年FTG的老年受體小鼠的生理變化。發(fā)現(xiàn)MCAO后中風(fēng)的患者和小鼠經(jīng)歷了體重減輕等生理變化，而到MCAO后的第14天，具有年輕生物群落的衰老小鼠已恢復(fù)到其中風(fēng)前的體重（體重增加約3％），而衰老的FTG小鼠在14天后未恢復(fù)到其原始體重。但是，沒(méi)有觀察到兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2. 中風(fēng)后年輕糞便微生物組的移植改善了中風(fēng)老年小鼠的行為。A，從年輕（2-3個(gè)月）和年齡較大（18-20個(gè)月）供體小鼠到中風(fēng)小鼠（18-20個(gè)月）。年輕時(shí)的體重（B），使用開(kāi)放視野測(cè)試（OFT，C）總運(yùn)動(dòng)能力，使用新型客觀識(shí)別測(cè)試（NORT，D）的認(rèn)知功能以及使用尾部懸吊測(cè)試（TST，E）的類(lèi)壓行為。并在MCAO之后的第14天老化了FTG（n=7）。在整個(gè)過(guò)程中，誤差線代表平均值±SEM。對(duì)于重復(fù)測(cè)量研究，線性混合模型用于說(shuō)明受試者內(nèi)部相關(guān)性（B和C）。在每次調(diào)整多次測(cè)試后，進(jìn)一步進(jìn)行組比較。對(duì)于兩組比較，在Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)（D和E）確定了數(shù)據(jù)的正態(tài)性，使用t檢驗(yàn)。

測(cè)試年輕腸道微生物群能否改善老年小鼠中風(fēng)后的結(jié)局，進(jìn)行了一系列行為測(cè)試，包括：（1）自發(fā)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的開(kāi)放視野測(cè)試（OFT）；（2）認(rèn)知功能的新型客觀識(shí)別測(cè)試（NORT）；（3）中風(fēng)后抑郁樣表型的尾部懸吊試驗(yàn)（TST）；（4）吊線試驗(yàn)的握力；（5）神經(jīng)功能缺損評(píng)分（NDS）作為中風(fēng)后總體缺損的量度。在卒中后第14天，兩組之間的NDS或吊線測(cè)試中均未有顯著差異。然而，與移植了老年FTG的老年小鼠相比，具有年輕FTG的老年中風(fēng)小鼠在OFT中表現(xiàn)出改善的運(yùn)動(dòng)活性，在NORT中具有更好的中風(fēng)后認(rèn)知。進(jìn)一步確定了FTG對(duì)中風(fēng)后抑郁表型的影響。年輕的菌群顯著降低了TST，具有抗抑郁樣作用。與中年FTG小鼠（20.3±2.5％）相比，年輕的微生物組移植組（19.7±3.1％），在卒中后14天通過(guò)腦萎縮測(cè)量的梗塞損害無(wú)顯著差異。這些發(fā)現(xiàn)表明，在年輕的FTG的衰老小鼠中，在活動(dòng)性（OFT），記憶力（NORT）和抑郁樣行為（TST）方面改善的中風(fēng)結(jié)局與梗死面積無(wú)關(guān)。

圖3. 年輕的FTG可增加固有層（LP）中的腸道調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞，并增強(qiáng)老年中風(fēng)小鼠上皮中的粘蛋白生成。A，流式細(xì)胞儀圖，用于鑒定老年中風(fēng)小鼠腸道LP中的T_reg細(xì)胞。將小腸（SI）和大腸（LI）的LP中的CD45⁺ CD4⁺Foxp3 ⁺細(xì)胞門(mén)控為T_reg細(xì)胞進(jìn)行分析。使用胺反應(yīng)性染色劑來(lái)鑒定活細(xì)胞和死細(xì)胞，僅活細(xì)胞被用于分析。圖代表SI LP中CD4 ⁺ T細(xì)胞的Foxp3 ⁺細(xì)胞的百分比。B，MCAO后第14天，老年中風(fēng)小鼠腸道LP中CD4 ⁺ T細(xì)胞和T_reg細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析（每組n=5）。C，MCAO后第14天對(duì)老年中風(fēng)小鼠的LI進(jìn)行Alcian（AB-PAS）染色（每組n=4），并定量每10個(gè)上隱窩/小鼠的成熟杯狀細(xì)胞數(shù)量。括號(hào)表示擁有成熟細(xì)胞的上部隱窩。比例尺：50μm。D，MCAO后第14天，對(duì)具有年齡（n＝4）和年輕的FTG（n＝5）的衰老小鼠進(jìn)行FITC-葡聚糖腸通透性測(cè)定。將數(shù)據(jù)歸一化為老年FTG對(duì)照組。E，在MCAO后第14天，老年中風(fēng)小鼠中LI的上皮粘蛋白基因和Reg3基因的相對(duì)mRNA豐度（每組n＝4）。在整個(gè)過(guò)程中，誤差棒代表平均值±SEM。根據(jù)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)評(píng)估的數(shù)據(jù)的正態(tài)性，使用了t檢驗(yàn)（B，C和D）和曼恩·惠特尼U檢驗(yàn)（E）。

中風(fēng)后的年輕FTG在腸道T細(xì)胞中賦予保護(hù)性表型并增強(qiáng)腸道完整性。在腸道中，微生物通過(guò)與幾種類(lèi)型的T淋巴細(xì)胞（特別是腸道固有層LP中的調(diào)節(jié)性T（T_reg）細(xì)胞）通信來(lái)形成局部免疫系統(tǒng)，這些細(xì)胞具有抗炎作用并抑制免疫反應(yīng)。分析了中風(fēng)小鼠FTG后小腸（SI）和大腸（LI）的LP。流式細(xì)胞儀分析顯示，患有年輕FTG的老年中風(fēng)小鼠沒(méi)有SI或LI LP中CD4 ⁺ T細(xì)胞的顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是，年輕的FTG顯著增加了SI LP中的CD4 ⁺ Foxp3 ⁺Treg細(xì)胞。年輕和老年FTG組之間沒(méi)有區(qū)別，表明通過(guò)FTG引入年輕的微生物群后，老年中風(fēng)小鼠的腸道T細(xì)胞獲得了調(diào)節(jié)表型。

圖4. 年輕的FTG在中風(fēng)小鼠的大腦中增加了T_reg細(xì)胞并減少了IL-17γδT細(xì)胞的產(chǎn)生。A，代表性的流式細(xì)胞儀圖，以鑒定T_reg細(xì)胞（CD45 ⁺ CD4 ⁺Foxp3 ⁺）在老年中風(fēng)小鼠的大腦中。B，MCAO后第14天，老年中風(fēng)小鼠腦中T_reg細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析（每組n＝5）。C，流式細(xì)胞圖，用于鑒定中風(fēng)小鼠大腦中的γδT細(xì)胞。在MCAO后第14天對(duì)IL-17 ⁺γδT細(xì)胞進(jìn)行了分析。使用胺反應(yīng)性活/死水活度染色劑來(lái)鑒定活細(xì)胞和死細(xì)胞。使用腦卒中半球進(jìn)行細(xì)胞分離，僅對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行門(mén)控以進(jìn)行（A）和（C）分析。大鼠腦γδT細(xì)胞（D）和IL-17 ⁺γδT細(xì)胞（E）的流式細(xì)胞儀分析MCAO后第14天的老年中風(fēng)小鼠（每組n=5）。在整個(gè)過(guò)程中，誤差線代表平均值±SEM。Shapiro-Wilk確認(rèn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性后，使用了t檢驗(yàn)（B，D和E）正常性測(cè)試。

中風(fēng)后年輕的FTG可增加老年大腦中的T_reg細(xì)胞并減少IL-17 ⁺γδT細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析顯示年輕的FTG明顯增強(qiáng)CD4 ⁺中Foxp3的表達(dá)，老年中風(fēng)小鼠同側(cè)中風(fēng)半球中的T細(xì)胞，表明年輕的微生物組可調(diào)節(jié)老年小鼠中風(fēng)后的神經(jīng)炎癥。綜上所述，年輕的FTG對(duì)老年人的有益影響，中風(fēng)小鼠是通過(guò)外周（即與腸道有關(guān)）機(jī)制和中樞調(diào)節(jié)機(jī)制介導(dǎo)的，即通過(guò)調(diào)節(jié)大腦的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生免疫力。

圖5. 卒中后糞便中SCFA的濃度隨著年齡的增長(zhǎng)而降低，并且聯(lián)合治療產(chǎn)生SCFA的細(xì)菌和益生元菊粉改善了老年小鼠的行為障礙。 衰老降低了幼鼠（2-3個(gè)月）和老年（18-20個(gè)月）小鼠糞便樣本中主要SCFA的濃度。收集糞便樣品并使用質(zhì)譜分析。圖表代表單個(gè)SCFA的變化（年輕生物群落，n=9；老化生物群落，n=10）。B，為了檢查菊粉和SCFA產(chǎn)生劑對(duì)中風(fēng)結(jié)果的影響，用1）媒介物，2）菊粉，3）SCFA產(chǎn)生劑和4）菊粉+SCFA產(chǎn)生劑對(duì)四組單獨(dú)的小鼠進(jìn)行口服破壞。對(duì)于SCFA生產(chǎn)者，新鮮培養(yǎng)長(zhǎng)雙歧桿菌（1x10⁷），共生梭狀芽胞桿菌（5x10⁶），praenitzii桿菌（1x10⁶）和發(fā)酵乳桿菌（1x10⁹）的混合物，并灌胃給小鼠。在MCAO后第14天進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分（NDS）（C），吊線測(cè)試（D）和TST（E）（單獨(dú)的菊粉，n=3；單獨(dú)的SCFA生產(chǎn)者，n=4；單獨(dú)的菊糖，n=4；菊粉+ SCFA生產(chǎn)者，n=5）。對(duì)于TST，排除了來(lái)自媒介物和菊粉治療組的兩只小鼠（每組一只），這些小鼠由于嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損而顯示出旋轉(zhuǎn)。NDS，hangwire測(cè)試和TST的總P值分別為0.0001、0.0004和0.0036。在整個(gè)過(guò)程中，誤差線代表平均值±SEM。為了進(jìn)行組比較，基于由Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)評(píng)估的數(shù)據(jù)的正態(tài)性，使用了Mann-Whitney U檢驗(yàn)（A）和普通的單向方差分析或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)（C，D和E），然后使用Dunnett's多重比較測(cè)試。

中風(fēng)后用SCFA生產(chǎn)菌進(jìn)行糞菌移植可改善衰老小鼠的恢復(fù)能力。與年齡較小的微生物群相比，含有較高SCFA的年輕微生物群的預(yù)處理有助于改善受體小鼠的中風(fēng)，卒中后SCFA的增加可以改善康復(fù)。為此，首先確定了本研究中用于FTG的糞便樣本中的SCFA是否不同。質(zhì)譜分析揭示了衰老與SCFA濃度之間存在反比關(guān)系：在卒中后用益生元（菊粉）和四種產(chǎn)生SCFA的主要細(xì)菌菌株（Bifidobacterium longum,Clostridium symbiosum, Faecalibacterium prausnitzii和Lactobacillusfermentum）的混合物對(duì)小鼠進(jìn)行了處理。與老化的微生物組相比，雙歧桿菌和梭狀芽胞桿菌這兩個(gè)屬被認(rèn)為是年輕微生物組的微生物特征。菊粉是一種可溶解的纖維，由于其可抵抗上消化道和SI的酶促降解，因此可以完整地到達(dá)結(jié)腸，是一種支持上述細(xì)菌增強(qiáng)SCFA產(chǎn)生的基質(zhì)。具有菊粉與SCFA-生產(chǎn)菌的中風(fēng)小鼠在中風(fēng)后第14天時(shí)神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著改善。此外，當(dāng)懸吊測(cè)試時(shí)，這組小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和強(qiáng)度有了顯著改善。與年輕的FTG后看到的效果相似，使用菊粉的SCFA生產(chǎn)菌在老年中風(fēng)小鼠中具有顯著的抗抑郁作用。未發(fā)現(xiàn)單獨(dú)服用菊粉的老年中風(fēng)小鼠具有明顯的行為益處，或單獨(dú)的細(xì)菌，提示菊粉與細(xì)菌具有協(xié)同作用。

圖6. 移植SCFA產(chǎn)生劑減少了老年中風(fēng)小鼠大腦IL-17γδT細(xì)胞的產(chǎn)生。A，代表性的流式細(xì)胞儀圖，用于鑒定老年中風(fēng)小鼠的大腦（同側(cè)中風(fēng)半球）中的γδT細(xì)胞。在FTG研究中使用了相同的門(mén)控策略。在MCAO后第14天對(duì)老年中風(fēng)小鼠的大腦γδT細(xì)胞（B）和IL17 ⁺γδT細(xì)胞（C）進(jìn)行了分析（每組n=5）。計(jì)算IL-17中值熒光強(qiáng)度（MFI）（D）。在整個(gè)過(guò)程中，誤差線代表平均值±SEM。使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)（B，C和D）。

具有SCFA生產(chǎn)菌和菊粉的中風(fēng)小鼠的大腦IL-17 ⁺γδT細(xì)胞減少。發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和菊粉治療可顯著降低IL-17，卒中后第14天為γδT細(xì)胞，而非γδT細(xì)胞，各組卒中后第14天的腦萎縮沒(méi)有差異。

圖7. 在SCFA生產(chǎn)者治療的中風(fēng)小鼠中的SCFA概況。在MCAO和Abx（第1天和第2天）和菊粉+細(xì)菌（第3天和第4天）處理后的第14天，從衰老的中風(fēng)小鼠中收集樣品。糞便（菊粉+細(xì)菌，n=8），血漿（菊粉+細(xì)菌，n=8）和大腦（菊粉+細(xì)菌，n=8）的變化。使用質(zhì)譜儀評(píng)估代謝產(chǎn)物。在整個(gè)過(guò)程中，誤差線代表平均值±SEM。根據(jù)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)評(píng)估的數(shù)據(jù)的正態(tài)性，使用了Mann Whitney U檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

增強(qiáng)的腸道SCFA可改變中風(fēng)小鼠的全身和大腦SCFA譜。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，中風(fēng)小鼠接受SCFA產(chǎn)生菌和菊粉后，沿上皮細(xì)胞顯著增強(qiáng)了LI杯狀細(xì)胞中表達(dá)的Muc2蛋白。表明SCFA可能是年輕微生物組中有益于老年小鼠中風(fēng)后恢復(fù)的關(guān)鍵成分。