【原】常規(guī)電鏡樣品制備標(biāo)準(zhǔn)方法及實(shí)驗(yàn)流程

生物學(xué)渣 2021-04-14

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常規(guī)電鏡樣品制備包括常溫化學(xué)雙固定、常溫脫水包埋、常規(guī)超薄切片、普通電鏡觀察幾個(gè)步驟。樣品制備過程歷時(shí)約一周，超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，電鏡觀察。所有操作均按照以下流程進(jìn)行。

試劑材料
0.2 mol/ L磷酸鹽緩沖液
Na2HPO4·2H2O 35.61 g 或Na2HPO4·7H2O 53.65 g / Na2HPO4·12H2O 71.64 g
NaH2PO2·H2O 27.60 g 或NaH2PO4·2H2O 31.21 g
加雙蒸水（ddH2O）到1000 mL
0.1 mol/ L磷酸鹽緩沖液（PBS）
0.2 mol/ L磷酸鹽緩沖液 250 mL
加雙蒸水到500 mL
2 % 低溫瓊脂
低溫瓊脂 1.0 g
加雙蒸水到 50 mL
加熱到沸騰，溶液均勻后備用
1 % 戊二醛固定液
25 %（m/v）戊二醛水溶液 2 mL
0.2 mol/ L磷酸鹽緩沖液 25 mL
加雙蒸水到50 mL
1 % 鋨酸固定液
2 %（m/v）鋨酸水溶液 10 mL
0.2 mol/ L磷酸鹽緩沖液 10 mL
包埋劑A液
Epon 812 樹脂 50 mL
十二烷基琥珀酸酐（modecenyl succinic anhydride, DDSA） 80 mL
包埋劑B液
Epon 812 樹脂 50 mL
六甲酸酐（methyl nadic anhydride, MNA） 44.5 mL
2，4，6 - 三甲氨基甲基苯酚（2, 4, 6 - tridimethylamino methyl phenol, DMP-30）
甲苯胺藍(lán)染液
甲苯胺藍(lán) 1 g
1 mol/ L NaOH 10 mL
加雙蒸水到50 mL
混勻過濾后使用
1 % 醋酸雙氧鈾染液
醋酸雙氧鈾 0.2 g
加雙蒸水到10 mL
封口膜封口，4℃避光保存
1 % 檸檬酸鉛染液
硝酸鉛 0.265 g
檸檬酸鈉（含2分子結(jié)晶水） 0.352 g
加雙蒸水到10 mL①
① 配制鉛染液時(shí)，要先加水6 mL，超聲震蕩30 min，使乳白色檸檬酸鉛懸液充分混勻。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃動，直至溶液變清亮。最后定容至10 mL。
② 細(xì)胞樣品處理和藻類及其他游離樣品處理流程可相互參照，即細(xì)胞樣品可以酌情使用瓊脂鑄模法取材固定，藻類及其他游離樣品也可以使用血清預(yù)包埋法取材固定，總體視樣品密度及其對于溫度的耐受等條件而定。
封口膜封口，4℃保存

儀器
修塊機(jī) Leica EM TRIM
切片機(jī) Leica EM UC6
光學(xué)顯微鏡 Nikon 80i 及配套拍照系統(tǒng)DS-L1
透射電子顯微鏡 JEOL-1230
Gatan Bioscan Camera 792

實(shí)驗(yàn)流程
一、取材與固定
A. 植物樣品
1. 自來水沖洗表面泥塵后，使用滅菌水清洗2-3次，置于鋪有預(yù)濕濾紙的培養(yǎng)皿中。
2. 使用干凈鋒利的刀片切取目標(biāo)材料，所取材料體積不大于3 mm3。
切取樣品時(shí)應(yīng)注意動作迅速、減小損傷，避免來回切拉；使用的滅菌水及器具應(yīng)4℃預(yù)冷，并在操作中盡量保持低溫以降低組織細(xì)胞活性。
3. 將切下材料放入裝有預(yù)冷的戊二醛固定液的青霉素小瓶中后抽氣，抽幾次后輕搖小瓶，并打開瓶蓋。重復(fù)2-3次，直到樣品沉入瓶底。
4. 室溫靜置1h，或搖床輕搖1h。
5. PBS清洗3次，10min/次。
6. 1%鋨酸固定液固定1h。
7. PBS清洗3次，10min/次。

B. 動物樣品
1. 4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗組織塊，迅速切取組織塊，體積不大于3 mm3
2. 將切取的組織塊投入裝有預(yù)冷戊二醛固定液的青霉素小瓶中，并抽氣直至樣品沉底。
3. 室溫靜置1h，或搖床輕搖1h。
4. PBS清洗3次，10 min/次。
5. 1%鋨酸固定液固定1 h。
6. PBS清洗3次，10 min/次。

C. 單層培養(yǎng)細(xì)胞或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞樣品②
1. 3000 rpm離心5 min，收集細(xì)胞樣品，盡量多的吸棄培養(yǎng)液上清。
2. 加入4℃預(yù)冷PBS液，充分吹吸混勻，靜置4 min，3000 rpm離心5 min，吸棄上清。
① 配制鉛染液時(shí)，要先加水6 mL，超聲震蕩30 min，使乳白色檸檬酸鉛懸液充分混勻。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃動，直至溶液變清亮。最后定容至10 mL。
② 細(xì)胞樣品處理和藻類及其他游離樣品處理流程可相互參照，即細(xì)胞樣品可以酌情使用瓊脂鑄模法取材固定，藻類及其他游離樣品也可以使用血清預(yù)包埋法取材固定，總體視樣品密度及其對于溫度的耐受等條件而定。
3. 重復(fù)步驟2一次。
4. 加入預(yù)冷的血清或蛋清，充分吹吸混勻，3000 rpm離心10 min，吸棄大部分上清，留少部分，吹吸懸浮沉淀細(xì)胞。（或離心后吸棄上清，留少部分上清，不懸浮沉淀細(xì)胞，視樣品濃度而定）
5. 緩慢加入戊二醛固定液，小心放入4℃冰箱，固定過夜。
6. 吸棄上清，刀片小心劃開離心管壁，用鉗子拉開離心管，小心取出已凝成固體的血清包埋塊。
7. 使用干凈的單面刀片或手術(shù)刀，將血清包埋塊切成2 mm3左右的小塊，取3-5個(gè)富集細(xì)胞樣品效果較好的包埋小塊繼續(xù)下面實(shí)驗(yàn)。
8. PBS清洗3次，10 min/次。
9. 1%鋨酸固定液固定1 h。
10. PBS清洗3次，10 min/次。

D. 藻類及其他游離培養(yǎng)樣品
1. 吸取2%低溫瓊脂液200μL到0.2mL離心管，并將離線管置于冰上，取10μL槍頭迅速插入瓊脂中并保持離心管豎直，且槍頭豎直靠中的包裹在瓊脂中。
2. 靜置1 min，待瓊脂凝固后，小心拔出槍頭，形成瓊脂空腔，待用。
3. 3000 rpm離心5 min，收集樣品，盡量多的吸棄培養(yǎng)液上清。
4. 加入4℃預(yù)冷PBS液，充分吹吸混勻，靜置4min，3000 rpm離心5min，吸棄上清。
5. 重復(fù)步驟2清洗，吸棄大部分上清，留極少部分上清液，吹吸懸浮樣品。
6. 使用10μL 移液器小心將樣品加入已經(jīng)制備好的瓊脂空腔中，使樣品充滿空腔大部分，添加過程中盡量避免氣泡出現(xiàn)。
7. 吸取50μL溶化的瓊脂，快速滴加到空腔瓊脂上封口，冰浴5 min，待瓊脂完全凝固。
8. 使用單面刀片小心劃開離心管壁，用鉗子拉開離心管，小心取出已凝成固體的瓊脂包埋塊，稍作修葺。
9. PBS清洗3次，10 min/次。
10. 1%鋨酸固定液固定1 h。
11. PBS清洗3次，10 min/次。

二、脫水
1. 按丙酮與滅菌水體積比3：7配制30%脫水劑。吸棄樣品管/瓶中的PBS，快速加入現(xiàn)配的脫水劑（脫水換液過程禁止出現(xiàn)樣品暴露空氣中現(xiàn)象，可不全部吸完，略有剩余，使樣品浸潤；動作應(yīng)迅速準(zhǔn)確），室溫放置或搖床輕搖45 min。加入按30%、50%、70%、90%、100%（v/v）的濃度梯度進(jìn)行脫水。
2. 配制50%脫水劑，快速換液，室溫輕搖45 min。
3. 配制70%脫水劑，快速換液，室溫輕搖45 min。
4. 配制90%脫水劑，快速換液，室溫輕搖45 min。
5. 使用純丙酮快速換液，室溫輕搖30 min③。
6. 重復(fù)步驟5一次。

三、滲透包埋
在此步脫水操作完成后即可開始配制滲透用包埋劑，以免安排不周。樣品浸泡在純丙酮中時(shí)間不宜過久，以免造成樣品較脆，不利于超薄切片。

1. 配制滲透用樹脂包埋劑
1) 取干凈的10 mL注射器，拔去活塞，用封閉針頭堵住注射口，放于通風(fēng)櫥中。
2) 小心傾倒B液9 mL到注射器中；然后再小心傾倒A液1 mL。
3) 插入活塞，堵住注射器后，顛倒搖勻至液體顏色均勻，無絲狀液體。
4) 小心拔去活塞，通風(fēng)櫥中操作，緩慢滴加14滴DMP-30。
5) 插入活塞，堵住注射器后，顛倒搖勻至液體顏色完全均勻，無絲絮狀分色，豎直放置待用。
2. 按照包埋劑與丙酮體積比3：7配制30%滲透劑，快速吸棄樣品管中純丙酮并加入滲透劑，輕搖滲透3 h。
3. 按照包埋劑與丙酮體積比7：3配制70%滲透劑，快速換液，輕搖滲透過夜。
4. 重新配制包埋劑，并小心推按注射器，將包埋劑擠到包埋模具中至液面略凸。
5. 解剖針挑取樣品到純包埋劑中，滲透3 h。
6. 小心挑取樣品，濾紙上稍微沾下吸棄部分粘附的包埋劑，輕輕放置到未滲透過樣品的包埋孔中，小心將樣品按到底，擺放好位置。記錄各樣品對應(yīng)包埋塊編號。
7. 梯度溫度聚合包埋
1) 37℃烘箱中12 h，期間定時(shí)觀察樣品有無漂移現(xiàn)象，如有，則再次小心擺放樣品位置。
2) 45℃烘箱中12 h。
3) 60℃烘箱中24 h。

四、修塊與切片
1. 拿到包埋塊后檢查樣品位置是否得當(dāng)，選取位置好的包埋塊優(yōu)先進(jìn)行修塊、切片。
2. 粗修包埋塊
1) 使用六角扳手將包埋塊固定在樣品頭上，露出長度合適。
2) 將樣品頭固定在修塊機(jī)上，體視鏡觀察修塊，分四個(gè)方向?qū)駢K頭部多余的包埋劑修去，暴露出組織塊。
3) 使用鋒利的單面刀片修去組織塊周圍毛刺的包埋劑，使其四邊光滑清晰。
4) 卸下樣品頭裝至切片機(jī)上，使用玻璃刀修片，直至樣品表面光滑清晰。
3. 半薄切片
1) 將粘有水槽的玻璃刀裝至切片機(jī)刀臺上，體視鏡下小心對刀，不時(shí)轉(zhuǎn)動手輪，使樣品上下移動，調(diào)整刀臺左右角度及樣品上下角度，直至包埋塊整個(gè)表面與刀刃的距離相等。
2) 轉(zhuǎn)動手輪，使整個(gè)樣品高于刀刃，點(diǎn)控制面板Start，設(shè)置切片區(qū)域上邊界；轉(zhuǎn)動手輪，使整個(gè)樣品低于刀刃，點(diǎn)控制面板End，設(shè)置切片區(qū)域下邊界。
3) 手動步進(jìn)刀臺靠近樣品，至出現(xiàn)彩色干涉光，繼續(xù)步進(jìn)刀臺，并通過體視鏡觀察干涉光譜變化，直至干涉光消失。
4) 轉(zhuǎn)動手輪，使樣品離開刀刃區(qū)域，使用滴管將干凈的去離子水加到玻璃刀水槽中，體視鏡觀察直至液面略低于刀刃。
5) 調(diào)整切片厚度與速度，按控制面板Run/Stop鍵，開始切片。體視鏡觀察可見900nm厚度切片反光為亮綠色。
6) 待有切片下來形成4-6片的切片帶，按Run/Stop鍵停止切片，體視鏡觀察下，使用睫毛筆將所需薄片撥離刀刃，并將所需切片聚攏一起。
7) 用干凈撈片環(huán)輕輕沾取切片所在區(qū)域，根據(jù)水膜表面張力撈取切片，放到干凈載玻片上，酒精燈略微加熱，使水蒸干，并對著光亮用記號筆標(biāo)示切片所在位置。
4. 半薄切片染色
1) 吸取20μL甲苯胺藍(lán)染液，滴加到載玻片放有切片的位置，室溫靜置30 s 。
2) 去離子水沖洗玻片，直至不再有藍(lán)色。吸水紙上瀝干，酒精燈略微加熱，加速切片上的水分蒸發(fā)。
3) 顯微鏡觀察切片質(zhì)量和樣品位置。
5. 精修包埋塊
1) 移去裝有水槽的玻璃刀，取下裝有包埋塊的樣品頭，裝至修塊機(jī)上。
2) 根據(jù)半薄切片結(jié)果，使用新的鋒利刀口，小心修理包埋塊四邊，使其盡可能的光滑、平整。
6. 超薄切片
1) 將鉆石刀裝至切片機(jī)刀臺上，體視鏡下小心對刀，不時(shí)轉(zhuǎn)動手輪，使樣品上下移動，調(diào)整刀臺左右角度及樣品上下角度，直至包埋塊整個(gè)表面與刀刃的距離相等。
2) 轉(zhuǎn)動手輪，使整個(gè)樣品高于刀刃，點(diǎn)控制面板Start，設(shè)置切片區(qū)域上邊界；轉(zhuǎn)動手輪，使整個(gè)樣品低于刀刃，點(diǎn)控制面板End，設(shè)置切片區(qū)域下邊界。
3) 手動步進(jìn)刀臺靠近樣品，至出現(xiàn)彩色干涉光，轉(zhuǎn)動手輪，使樣品上下移動，調(diào)整刀臺左右角度及樣品上下角度，直至包埋塊整個(gè)表面與刀刃的干涉光譜顏色一致；繼續(xù)步進(jìn)刀臺，并通過體視鏡觀察干涉光譜變化，直至干涉光消失。
4) 轉(zhuǎn)動手輪，使樣品離開刀刃區(qū)域，使用滴管將干凈的去離子水加到玻璃刀水槽中，體視鏡觀察直至液面略低于刀刃。
5) 調(diào)整切片厚度與速度，按控制面板Run/Stop鍵，開始切片。體視鏡觀察可見70nm厚度切片反光為亮灰色及淺灰色。
6) 待有切片下來形成10-20片的切片帶，按Run/Stop鍵停止切片，體視鏡觀察下，使用睫毛筆將所需薄片撥離刀刃，并將所需切片聚攏一起。
7) 用干凈撈片環(huán)輕輕沾取切片所在區(qū)域，根據(jù)水膜表面張力撈取切片，輕輕放到干凈載膜銅網(wǎng)上，用尖角濾紙靠近銅網(wǎng)邊緣緩慢吸干水分。
8) 輕輕移去撈片環(huán)，將載有切片的銅網(wǎng)放到鋪有濾紙的平皿中，晾干待染色觀察。

五、染色
1. 醋酸雙氧鈾染色
1) 按每片載網(wǎng)20μL染液的量吸取醋酸雙氧鈾染液，13 200 rpm離心5 min。
2) 將放有切片的載網(wǎng)小心放到染色盤上，有切片面靠上，并稍微用鑷子按載網(wǎng)邊緣，使其與染色盤接觸粘附牢固。
3) 吸取20μL染液滴加到載網(wǎng)上面，蓋上平皿防塵，室溫染色30 min。
4) 將染色盤整個(gè)放到裝有去離子水的清洗缸中，輕搖清洗1 min。
5) 小心取出染色盤，更換水洗液，輕搖清洗5min。
6) 重復(fù)清洗2次。
2. 檸檬酸鉛染色
1) 按每片載網(wǎng)20μL染液的量吸取醋酸雙氧鈾染液，13 200 rpm離心5 min。④
2) 在放置染色盤的平皿中放入2片固體NaOH，用以吸收平皿中CO2氣體。
3) 吸取20μL染液滴加到載網(wǎng)上面，蓋上平皿防塵，室溫染色8 min。
4) 將染色盤整個(gè)放到裝有去離子水的清洗缸中，輕搖清洗1 min。
5) 小心取出染色盤，更換水洗液，輕搖清洗5min。
連續(xù)染色時(shí)，載網(wǎng)不需要從染色盤上拿下，清洗后直接進(jìn)行鉛染即可，但是鉛染液要現(xiàn)用現(xiàn)取。
6) 重復(fù)清洗2次。
7) 小心夾取載網(wǎng)，放置到鋪有濾紙的干凈平皿中，晾干待電鏡觀察。

六、電鏡觀察
1. 取出樣品桿，打開樣品夾，小心放入載網(wǎng)，合上樣品夾，并轉(zhuǎn)動樣品桿，輕敲確保樣品夾已準(zhǔn)確固定載網(wǎng)。
2. 將樣品桿插入透射電鏡樣品室，開始抽氣。
3. 打開燈絲開關(guān)，等待檢測電流出現(xiàn)后，打開觀察窗開始觀察。
4. 先在低倍下找到切片，再高倍觀察切片，尋找待看目標(biāo)，仔細(xì)對焦。
5. 將切片目標(biāo)區(qū)域遇到觀察窗中間后，調(diào)整燈絲電流密度為3.8 pA/cm2。
6. 插入拍照CCD，Start View，微調(diào)焦距，Start Acquire 拍照。
7. 拍照完畢，按格式需求保存照片到指定文件夾。
8. 使用專用寫保護(hù)閃存盤拷貝數(shù)據(jù)到公共電腦觀察、使用。