 本發(fā)明涉及提純 技術(shù)領(lǐng)域： ，特別是一種黃芪多糖的提純方法。 背景技術(shù)： ：黃芪，豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，春、秋二季采挖，除去須根和根頭，曬干。味甘,性微溫，具有補(bǔ)氣升陽，生津養(yǎng)血，利水消腫，固表止汗，行滯通痹等功效。用于氣虛乏力，食少便溏，中氣下陷，久瀉脫肛等癥。黃芪主要成分為黃芪多糖、皂甙、黃酮、維生素、微量元素，其中黃芪多糖、皂苷類成分、黃酮為多種藥理作用的有效成分。其中對(duì)黃芪多糖的研究報(bào)道比較多。近年來，從自然資源中分離和研究具有保健作用的新型生物活性成分引起了很大的興趣。黃芪，是比較受歡迎的促進(jìn)健康的中藥材之一，干燥根歷來被用作免疫調(diào)節(jié)劑，用于治療感冒，腹瀉，乏力和食欲不振，已經(jīng)有超過了2000多年的歷史?，F(xiàn)代植物化學(xué)和藥理實(shí)驗(yàn)證明，黃芪多糖是黃芪根的主要活性成分之一，具有各種重要生物活性，例如免疫調(diào)節(jié)，抗氧化，抗腫瘤，抗糖尿病，抗病毒，保肝，抗發(fā)炎，抗動(dòng)脈粥樣硬化，造血和保護(hù)作用。多糖又稱多聚糖，是由醛糖或酮糖通過脫水形成糖苷鍵，是由糖苷鍵線性或分枝連接而成的鏈狀聚合物。據(jù)報(bào)道黃芪多糖中蛋白質(zhì)含量高于15％，所以除去蛋白質(zhì)是多糖提取純化的一個(gè)關(guān)鍵步驟。脫蛋白的方法主要有蛋白酶解法、sevage法、三氯乙酸法及鹽析等方法。單用蛋白酶脫除蛋白，作用比較溫和，但受到酶專一性的限制及后續(xù)處理麻煩；單用Sevage法不僅使用大量的有機(jī)試劑并且會(huì)損失一部分糖蛋白；因此，黃芪多糖提純方法的改進(jìn)和創(chuàng)新是目前亟需解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種黃芪多糖的提純方法，可有效解決黃芪多糖的提純問題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，包括以下步驟：1）黃芪多糖提?。簩⒏稍锏狞S芪飲片粉碎過2號(hào)篩，水提，固液比1:12-1:20提取多糖，回流提取60-90min，過濾，收集濾液，重復(fù)提取三次，合并濾液，將提取液濃縮至120-200mL，加入提取液4-6倍體積的無水乙醇，密封沉淀16-24h，重復(fù)三次，下層水浴烘干，得粗提物，冷凍干燥，備用；2）脫蛋白：將0.2g粗提物凍干粉溶解于50-100mL蒸餾水中（pH4.5-7.0），加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶用量為粗提物凍干粉重量的0.75-5.0%，在35-70℃酶解4-24h，然后與15-30mLsevage試劑混合，靜止5-15min分離，取上層清液，重復(fù)兩次，水浴烘干，凍干后測定多糖與蛋白含量。所述的sevage試劑是氯仿︰正丁醇=4︰1。本發(fā)明為能更徹底地除去多糖中的蛋白質(zhì)，不會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，并且減少了有機(jī)試劑的用量，提高了除蛋白質(zhì)效率，同時(shí)也提高了多糖純度，是黃芪多糖提純方法上的創(chuàng)新。附圖說明圖1為本發(fā)明黃芪多糖脫蛋白的酶解時(shí)間考察結(jié)果圖（●多糖含量；◆蛋白質(zhì)含量）。圖2為本發(fā)明黃芪多糖脫蛋白的酶底比考察結(jié)果圖（●多糖含量；◆蛋白質(zhì)含量）。圖3為本發(fā)明黃芪多糖脫蛋白的酶解PH考察結(jié)果圖（●多糖含量；◆蛋白質(zhì)含量）。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1本發(fā)明在具體實(shí)施時(shí)，包括以下步驟：1）黃芪多糖提?。簩⒏稍锏狞S芪飲片粉碎過2號(hào)篩，水提，固液比1:13提取多糖，回流提取70min，過濾，收集濾液，重復(fù)提取三次，合并濾液，將提取液濃縮至130mL，加入提取液4倍體積的無水乙醇，密封沉淀16h，重復(fù)三次，下層水浴烘干，得粗提物，冷凍干燥，備用；2）脫蛋白：將0.2g粗提物凍干粉溶解于pH值為4.5的60mL蒸餾水中，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶用量為粗提物凍干粉重量的1.0%，在35℃酶解6h，然后與16mLsevage試劑混合，靜止6min分離，取上層清液，重復(fù)兩次，水浴烘干，凍干后測定多糖與蛋白含量。實(shí)施例2本發(fā)明在具體實(shí)施時(shí)，包括以下步驟：1）黃芪多糖提取：將干燥的黃芪飲片粉碎過2號(hào)篩，水提，固液比1:15提取多糖，回流提取80min，過濾，收集濾液，重復(fù)提取三次，合并濾液，將提取液濃縮至160mL，加入提取液5倍體積的無水乙醇，密封沉淀20h，重復(fù)三次，下層水浴烘干，得粗提物，冷凍干燥，備用；2）脫蛋白：將0.2g粗提物凍干粉溶解于pH值為5.0的70mL蒸餾水中，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶用量為粗提物凍干粉重量的2%，在50℃酶解12h，然后與25mLsevage試劑混合，靜止10min分離，取上層清液，重復(fù)兩次，水浴烘干，凍干后測定多糖與蛋白含量。實(shí)施例3本發(fā)明在具體實(shí)施時(shí)，包括以下步驟：1）黃芪多糖提取：將干燥的黃芪飲片粉碎過2號(hào)篩，水提，固液比1:20提取多糖，回流提取90min，過濾，收集濾液，重復(fù)提取三次，合并濾液，將提取液濃縮至200mL，加入提取液6倍體積的無水乙醇，密封沉淀24h，重復(fù)三次，下層水浴烘干，得粗提物，冷凍干燥，備用；2）脫蛋白：將0.2g粗提物凍干粉溶解于pH值為7.0的100mL蒸餾水中，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶用量為粗提物凍干粉重量的5.0%，在70℃酶解24h，然后與30mLsevage試劑混合，靜止15min分離，取上層清液，重復(fù)兩次，水浴烘干，凍干后測定多糖與蛋白含量。本發(fā)明方法對(duì)黃芪多糖的提純方法進(jìn)行了單因素與正交試驗(yàn)考察，以多糖含量與蛋白脫除率為考核指標(biāo)，獲得了黃芪多糖的優(yōu)化提純方法，經(jīng)實(shí)際應(yīng)用和測試，與試驗(yàn)測試結(jié)果相一致，表明方法穩(wěn)定可靠，黃芪多糖提純效果好，具體試驗(yàn)資料如下：1、黃芪多糖脫蛋白的單因素考察：1.1酶解時(shí)間的考察：精密稱取5份200.0mg的樣品（粗提物凍干粉），分別加入PH為7.00的溶液超聲溶解，定容置100mL的容量瓶中，分別加入2.00mL濃度為1.00mg·mL-1木瓜蛋白酶溶液，在溫度50℃的條件下保溫酶解，對(duì)酶解時(shí)間進(jìn)行考察，分別酶解4，6，8，12，24h，再分別用sevage法萃取2次，離心后取上層的多糖溶液置干凈的蒸發(fā)皿中，水浴揮干溶劑后冷凍干燥24h，然后采用苯酚硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法測定多糖和蛋白質(zhì)的含量（如圖1所示）。1.2酶底比的考察：精密稱取5份200.0mg樣品，用PH為7.00的溶液溶解定容置100mL的容量瓶中，對(duì)酶底比進(jìn)行考察，分別加入濃度為1.00mg·mL-1木瓜蛋白酶溶液1.50，2.00，2.40，4.00，5.00mL，在溫度50℃的條件下保溫酶解8h，再分別用sevage法萃取2次，取上層的多糖溶液再離心后置蒸發(fā)皿中，水浴揮干溶劑后冷凍干燥24h，然后采用苯酚硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法測定多糖和蛋白質(zhì)的含量（如圖2所示）。1.3酶解PH的考察：精密稱取5份200.0mg樣品，對(duì)酶解PH進(jìn)行考察，分別用PH為4.50，5.00，5.50，6.00，7.00的溶液溶解定容置100mL的容量瓶中，分別加入濃度為1.00mg·mL-1木瓜蛋白酶溶液2.00mL，在溫度50℃的條件下保溫酶解8h，再分別用sevage法萃取2次，取上層的多糖溶液離心后置蒸發(fā)皿中，水浴揮干溶劑后冷凍干燥24h，然后采用苯酚硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法測定多糖含量和蛋白質(zhì)的含量（如圖3所示）。2、黃芪多糖脫蛋白的正交試驗(yàn)根據(jù)所做單因素水平試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解時(shí)間、酶底比、溫度、PH為考察因素，進(jìn)行L9（34）的正交試驗(yàn)，各因素的水平設(shè)計(jì)如表1。精密稱取黃芪粗多糖九份，每份200.0mg，分別按L9（34）表中給出的條件進(jìn)行酶解相應(yīng)的時(shí)間，再分別用sevage法萃取2次，離心后取上層的多糖溶液置蒸發(fā)皿中，水浴揮干溶劑后冷凍干燥24h，再分別稱取10.0mg，蒸餾水溶解定容置100mL的容量瓶中，用紫外分光光度計(jì)在波長595nm處檢測蛋白質(zhì)含量，在波長490nm處檢測黃芪多糖的含量。根據(jù)以下正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，按照設(shè)計(jì)好的工藝進(jìn)行試驗(yàn)。以多糖的含量和蛋白質(zhì)的脫除率為指標(biāo)，兩者重要程度相等，采用綜合評(píng)分法對(duì)兩種指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分后，用正交設(shè)計(jì)軟件處理得到黃芪多糖的含量結(jié)果和方差分析結(jié)果，其結(jié)果見表1和表2。由方差分析結(jié)果可知，影響黃芪多糖脫蛋白質(zhì)效率的各因素主次關(guān)系為D>C>A>B，因素C、D具有顯著性影響，因素A、B影響較小。正交試驗(yàn)分析得出脫蛋白的最佳組合為A3B3C2D1，即酶底比為2.00%，pH值為5.00，50℃水浴酶解24h，黃芪多糖的蛋白脫除率89.82%，多糖的含量83.48%。表1黃芪多糖脫蛋白的正交試驗(yàn)分析No.A酶解時(shí)間/hB酶底比/%C溫度/℃D/pH多糖含量/%蛋白質(zhì)脫除率/%綜合評(píng)分/%180.7540574.8391.19166.02281.0050675.1092.57167.67382.0060777.3281.83159.154120.7550777.9083.62161.525121.0060582.8082.52165.326122.0040677.1586.38163.537240.7560676.4987.20163.698241.0040770.8088.72159.529242.0050583.4889.82173.30K1492.84491.23489.07504.64K2490.37492.51502.49494.89K3496.51495.98488.16480.19R6.144.7514.3324.45表2綜合評(píng)分方差分析因素SSfMSFPA6.36323.1821.580>0.05B4.02722.013C42.919221.46010.658>0.05D100.995250.49825.080<0.05注：F0.05（2，2）=19.00。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)從植物中提取的多糖大多數(shù)含有大量的蛋白質(zhì)，影響多糖的純度，所以除去多糖中的蛋白質(zhì)是多糖純化的重要步驟。目前，多糖除蛋白主要有Sevage法、三氟乙酸法、鹽酸法、酶法等方法，單用酶法，雖然安全、高效但是受到酶專一性的影響，對(duì)除去植物多糖中的蛋白質(zhì)也有一定的限制條件，且必須有后續(xù)多糖蛋白的分離程序。單用sevage法只能除去游離水溶性的蛋白質(zhì)，并且有機(jī)試劑的用量比較大，比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且對(duì)人體有害。本發(fā)明采用酶-Sevage法結(jié)合,多糖溶液經(jīng)過酶的酶解,游離蛋白質(zhì)及部分與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)被酶解,在酶的作用下，分解結(jié)合的糖蛋白，使其大量的蛋白質(zhì)游離，然后使用Sevage法除去游離的蛋白質(zhì)，這樣便能更徹底地除去多糖溶液中的蛋白質(zhì)，同時(shí)也提高了多糖的純度，僅需少量的有機(jī)試劑,即可達(dá)到去除蛋白的良好效果,降低了有機(jī)試劑的使用量和多糖損失量。本發(fā)明創(chuàng)造性的將兩種方法連用，不僅可以除去大量的蛋白質(zhì)，不會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，并且減少了有機(jī)試劑的用量，提高了除蛋白質(zhì)效率，同時(shí)提高多糖純度，是黃芪多糖提純方法上的創(chuàng)新。(2)本發(fā)明對(duì)黃芪多糖除蛋白的提純方法進(jìn)行了研究，采用水提醇沉的提取方法提取黃芪多糖，以蛋白質(zhì)的脫除率和多糖的含量為指標(biāo)，通過單因素考察和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并利用綜合評(píng)分法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，本發(fā)明系統(tǒng)研究了黃芪多糖的脫蛋白提純方法，試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合單因素與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，使得優(yōu)化提純方法更接近實(shí)際、更具可行性，具有良好的推廣和應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前第1頁1 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