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前言 乙型肝炎病毒（HBV）感染可引發(fā)慢性肝炎、肝硬化、肝細胞性肝癌（HCC）等，嚴重危害全球人類健康，并造成巨大的社會負擔。HBV病毒基因組為松弛型的部分雙鏈的環(huán)狀DNA（rcDNA），以前基因組RNA（pgRNA）為模板逆轉錄形成。HBV感染宿主細胞后，rcDNA會入核并轉化為共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。cccDNA在宿主細胞核內長期穩(wěn)定且難以被徹底清除，其能借助宿主細胞的轉錄體系轉錄表達HBV的各類轉錄本，被認為是HBV感染慢性化和難以清除的罪魁禍首。 盡管已有研究顯示HBV cccDNA在組裝形成過程中會加入宿主細胞組蛋白，但對于哪些組蛋白會富集在cccDNA上以及富集的機制仍有很多不解。除了cccDNA，整合型的HBV DNA在肝細胞病化的過程中也起著關鍵的作用，而對于這類HBV DNA與宿主細胞的相互作用機制也不十分明確?；谶@些原因，我們采用了一種高敏感度的方法——high-throughput genome-wide translocation sequencing-coupled chromosome conformation capture（HTGTS-3C），在全基因組層面上檢測了HBV DNA與宿主DNA的相互作用，揭示了HBV cccDNA和整合的HBV與宿主基因相互作用的空間圖譜。同時，也進一步證實了HBV能與宿主基因組共享表觀遺傳相關機制。  首先，利用HTGTS-3C技術，我們在HepG2-NTCP和HepAD38細胞系發(fā)現(xiàn)了HBV DNA與宿主DNA的接觸，這種接觸會以不同密度分布于所有的染色體上，但每條染色體上的分布密度存在顯著差異。其中在13、15、18、21、X、Y號染色體上，只有較少的HBV DNA與宿主DNA接觸點，而16、17、19、30號染色體具有更多的接觸點。這些結果說明HBV與宿主DNA的接觸是非隨機性的（圖1）。  圖1：宿主基因組中HBV-DNA與宿主DNA接觸點的分布 我們接著提出問題，HBV與宿主DNA相互接觸的分布與什么因素有關？我們知道，在HBV cccDNA在組裝過程中，cccDNA上會加入宿主細胞的組蛋白，而細胞的組蛋白修飾與宿主細胞的基因表達有關，因此HBV cccDNA的轉錄活動是否也與宿主細胞的組蛋白的修飾情況相關呢？根據(jù)之前的報道，cccDNA上存在包括H3K4me2，H3K4me3，H3K9ac，H3K27ac，H3K36me3和H3K9me3在內的一系列組蛋白修飾。而無論在宿主細胞還是HBV DNA上，H3K4me2，H3K4me3，H3K9ac，H3K27ac，H3K36me3與活躍的基因表達有關，H3K9me3則與基因表達沉默相關?；诖耍覀円?50kb為檢測尺度，檢測HBV DNA在每條染色體上的富集與宿主DNA上不同的組蛋白修飾分布的相關性，并發(fā)現(xiàn)HBV DNA與宿主DNA的接觸區(qū)域與H3K4me2，H3K4me3，H3K9ac，H3K27ac，H3K36me3修飾富集區(qū)域正相關，而與H3K9me3修飾富集區(qū)域負相關（圖2）。考慮到H3K4me3修飾多位于轉錄起始位點（TSSs）、H3K27ac修飾多預示著激活的啟動子與增強子，因此我們進一步檢測了HBV DNA與宿主細胞接觸區(qū)域的密度與TSSs、增強子、CpG島等組件的密度之間的相關性。誠如預期，我們發(fā)現(xiàn)HBV DNA也與宿主DNA上這些轉錄激活位點的富集情況成正相關。綜合這些實驗結果，我們認為HBV DNA與宿主DNA的接觸更傾向于集中在基因表達活躍的區(qū)域，同時我們的結果還為HBV DNA與宿主DNA之間共享的組蛋白調節(jié)器分布情況提供了一個三維結構框架。  圖2：HBV DNA與宿主DNA的接觸更傾向于集中于轉錄活性高的區(qū)域 在這些實驗中，除了那些被報道過的HBV cccDNA上的組蛋白修飾以外，我們還發(fā)現(xiàn)宿主細胞基因組上的H3K4me1修飾的分布密度也同樣與HBV DNA和宿主DNA的接觸點的密度正相關，在HBV cccDNA的組蛋白中也存在H3K4me1的相關修飾（圖2a-c）。為了進一步證明H3K4me1對HBV DNA轉錄與復制的作用，我們在HepAD38細胞系中敲低了H3K4me1的兩個關鍵甲基轉移酶KMT2C和KMT2D，發(fā)現(xiàn)HBV的RNA表達顯著降低（圖3a-e），同樣的，HBeAg和HBsAg的表達也顯著降低（圖3f-g）。結合這些結果，我們認為H3K4me1修飾會富集于HBV DNA上，并對HBV的相關基因的表達進行調控。  圖3：KMT2C/D調控HBV轉錄 由于HBV引起的HCC與HBV在宿主基因組中的整合相關，因此我們同樣想了解整合型的HBV DNA與宿主DNA之間接觸的特點。通過HTGTS-3C技術，我們進一步展示了在2與21號染色體上HBV與宿主DNA之間的接觸位點（圖4a-b），并且看到HBV DNA能在2號染色體上形成了一個染色質環(huán)（chromatin loop）的結構。通過與HepG2細胞系的表觀修飾分布進行比對發(fā)現(xiàn)，在2號染色體的HBV DNA與宿主DNA接觸密集的位點上，H3K27ac，H3K9ac和H3Kme1修飾都存在一定程度的富集，而H3K9me3修飾則較少出現(xiàn)；而在21號染色體上，宿主DNA的組蛋白修飾的分布基本不存在偏好性，但H3K9me3修飾在整條染色體上都有較高水平的表達。這些結果表明，整合型的HBV DNA會在細胞轉錄活躍區(qū)域與宿主DNA接觸，在接觸的過程中還能形成一個染色質環(huán)的結構。  圖4：在染色體中整合的HBV DNA的基因組構造 接著，利用RNA測序（RNA-seq）技術發(fā)現(xiàn)，在能表達完整HBV的HepAD38細胞系中去除DOX的抑制后，有364個基因表達上調，535個基因表達下調（圖5a）。在這些受影響的基因中，大部分都集中于HIF-1信號通路。我們通過比對HBV DNA與宿主DNA接觸的區(qū)域和RNA-seq的結果，發(fā)現(xiàn)HBV對宿主基因表達的影響主要是與HBV DNA與宿主DNA的接觸有關（圖5b）。在對表達受HBV接觸影響的宿主基因進行通路富集分析后發(fā)現(xiàn)，這些受影響的基因富集于甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用途徑（圖5c）。我們還發(fā)現(xiàn)，受到HBV分泌的誘導影響的上調基因也在2號染色體的HBV DNA整合位點附近有富集。以上結果表明，HBV感染引起的宿主細胞基因表達變化主要是與HBV DNA與宿主DNA之間的接觸有關。  圖5：HBV DNA與宿主DNA的接觸對宿主基因表達的影響  結論  綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染后宿主細胞內廣泛存在HBV DNA與宿主DNA相互接觸的現(xiàn)象。這些接觸并不是隨機分布于宿主的所有染色體上，而是傾向于富集在宿主細胞的基因表達活躍區(qū)。同時，HBV DNA與宿主DNA的接觸能在KMT2C/D的幫助下富集H3K4me1組蛋白修飾。而H3K4me1修飾會有助于激活HBV的轉錄活性，從而影響HBV的表達。另外，整合在宿主細胞基因組中的HBV DNA還能在轉錄活性區(qū)域形成染色質環(huán)狀結構。最后，HBV的感染會通過HBV DNA與宿主細胞DNA接觸來影響宿主細胞的基因表達。這些發(fā)現(xiàn)揭示了部分HBV與宿主細胞DNA相互作用的3D結構，這為我們更好地理解HBV引起的相關肝病進展的機制做出貢獻。 相關論文信息： https:///10.1038/s41421-020-00218-1 Cell 174, 102–116. e114 (2018) |
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