膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，占所有腫瘤的14.6％和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的惡性腫瘤的48.3％。由于GBM具有高度侵略性，GBM患者在數(shù)天或數(shù)月內(nèi)會迅速發(fā)生神經(jīng)功能缺損，癲癇發(fā)作和顱內(nèi)高壓癥狀。盡管在包括手術(shù)切除，放療和化學(xué)療法在內(nèi)的各種治療方法的開發(fā)方面取得了長足的進步，但在過去的幾十年中，在延長生存期和改善預(yù)后方面進展甚微。癌癥干細胞（CSC）的分化過程中在腫瘤微環(huán)境影響癌細胞多種因素，導(dǎo)致異源細胞分化狀態(tài)和細胞命運。單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析已成為一種強大的方法，可通過以顯微鏡分辨率同時研究整個腫瘤樣品的基因組的全面性質(zhì)，來提供表征細胞狀態(tài)及其轉(zhuǎn)變的機會。將這種綜合的組成腫瘤的細胞排列成軌跡，有助于根據(jù)分化狀態(tài)了解腫瘤細胞亞群，并揭示伴隨細胞命運規(guī)范的遺傳級聯(lián)和相關(guān)致瘤途徑。然而，尚不清楚GBM細胞是否處于不同的分化狀態(tài)，以及基于細胞分化軌跡的GBM患者新分類是否與腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)，并在預(yù)測患者存活率和免疫治療反應(yīng)中發(fā)揮作用。

根據(jù)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和GBM scRNA-seq數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化，排除了194個低質(zhì)量細胞，來自GBM核心的2149個細胞納入分析。檢測到的基因數(shù)量與測序深度顯著相關(guān)?？偣舶?9,752個對應(yīng)基因，方差分析顯示1,500個高度變異基因。采用主成分分析(PCA)確定可用維度并篩選相關(guān)基因。但是PCA結(jié)果并未證明GBM中細胞間存在明顯的分離。選擇了20個P值<0.05主要成分（PCs）以進行后續(xù)分析。

圖1. 基于單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)的13個細胞簇

應(yīng)用tSNE算法，并將人類GBM中的細胞成功分類為13個獨立簇。差異表達分析共鑒定自13個聚類的8,025個標(biāo)記基因。根據(jù)標(biāo)記基因的表達模式，這些簇被標(biāo)記為singleR和CellMarker。包含518個單元的簇0注釋為GBM CSC；包含878個細胞的簇1、2、6和10標(biāo)注為GBM癌細胞或GBM細胞；包含196個細胞的簇3標(biāo)注為星形膠質(zhì)細胞；包含44個細胞的簇11被標(biāo)注為少突膠質(zhì)細胞。包含319個細胞的簇4、5和9被標(biāo)注為腫瘤相關(guān)的巨噬細胞；包含77個細胞的簇8被注釋為典型的M1巨噬細胞；包含81個細胞的簇7被注釋為典型的M2巨噬細胞；將包含36個單元的簇12標(biāo)記為T細胞。

通過軌跡分析將GBMs中的所有細胞投射到一個根和兩個分支上。結(jié)果表明，GBM CSCs主要位于根中，而GBM細胞主要位于分支中。有趣的是，分支I中的GBM細胞（這里定義為I型GBM細胞）全部來自簇2、6和10（434個細胞），而分支II中的GBM癌細胞（這里定義為II型GBM細胞）全部來自簇1（444個單元）。I型和II型GBM亞群中細胞的分化程度差異很大。將I型和II型GBM細胞的分支依賴性標(biāo)記基因為GDRGs。進行差異分析，并將265個標(biāo)記基因鑒定為I型GDRG，將193個標(biāo)記基因鑒定為II型GDRG。因此，GBM中最終鑒定出總共498個GDRG。

圖2. 不同分化模式的細胞亞群的GO注釋、軌跡分析和GSEA

進行基因集富集分析（GSEA），以鑒定具有不同分化模式的GBM細胞的相關(guān)分子機制和途徑。結(jié)果顯示，I型GDRGs與免疫過程的調(diào)節(jié)呈負相關(guān)，例如抗原加工和免疫細胞分化，II型GDRGs與代謝相關(guān)途徑（如碳代謝）呈顯著正相關(guān)（氨基酸的生物合成，糖酵解和糖異生）。GDRGs的這些發(fā)現(xiàn)表明，處于不同分化狀態(tài)的GBM細胞表現(xiàn)出獨特的腫瘤生物學(xué)特征，這可能為GBM的分子標(biāo)記（包括內(nèi)在特性和相關(guān)通路的調(diào)控）提供新的證據(jù)。

然后確定是否可以使用大量RNA-seq數(shù)據(jù)識別觀察到的GBM細胞亞群。如在所示圖3A - 4C，相關(guān)性分析表明，無論是TCGA數(shù)據(jù)庫還是CGGA數(shù)據(jù)庫，I型GDRGs的scRNA-seq數(shù)據(jù)與bulk RNA-seq數(shù)據(jù)高度相關(guān)II型GDRGs。這些發(fā)現(xiàn)表明，I型和II型GBM細胞也可以通過大量RNA-seq數(shù)據(jù)通過GDRG的表達來識別，因為這些高度相關(guān)的基因可能表明一個共同的細胞起源。

圖3. 兩種GDRG亞型的相關(guān)性分析和體細胞突變分析

為確定來自不同GBM細胞亞群的基因譜是否在功能上相關(guān)，作者利用metagens來代表相應(yīng)基因譜的總體表達模式。I型和II型元基因(分別由I型和II型gdrg組成)的表達量是由組成基因表達的加權(quán)平均數(shù)得出的。結(jié)果顯示I型和II型metagene表達之間之存在很強的相關(guān)性，并在scRNA-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)II型基因表達譜表達。表明I型和II型GDRGs功能相關(guān),功能上相關(guān)的具有不同區(qū)分模式的不同GBM子集。

作者還分析了TCGA隊列中GDRG的體細胞突變狀態(tài)。大多數(shù)GDRG（90.8％，452/498）存在突變。表皮生長因子受體（EGFR）表現(xiàn)出最高的突變頻率（53％），其次是CDK4（16％）和TSPAN31（16％）。I型GDRGs中有246個基因（92.8％）具有突變，II型GDRGs中有262個基因（89.4％）具有突變。兩組之間的突變頻率無統(tǒng)計學(xué)意義。但是，排名前9位的GDRG中有8個是II型GDRG，而只有1個是I型GDRG。這些結(jié)果表明，GDRGs的突變狀態(tài)具有高度的異質(zhì)性，提示GDRGs在GBMs的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

為建立基于GDRGs的表達模式的GBM分類，對來自TCGA數(shù)據(jù)庫的151名GBM患者進行了基于機器學(xué)習(xí)的無監(jiān)督共識聚類。根據(jù)累積分布函數(shù)（CDF）曲線和共識熱圖下面積的相對變化，確定最佳簇數(shù)為兩個（k值= 2），并且在CDF下面積未觀察到明顯的增加。曲線（圖5A – 5C）。因此，所有GBMs分為兩組：分子簇1 (MC1)的80例(53.0%)和分子簇2 (MC2)的71例(47.0%)。Kaplan-Meier生存分析表明，MC1 GBM的患者的OS顯著低于MC2 GBM的患者。

圖4.GBM患者基于GDRG的分類的識別和驗證

之后在CGGA隊列中驗證了GDRG的分類。如在所示圖5G - 5I，也被確定的簇的最佳數(shù)目是兩個（k值= 2），并且將患者還歸類為MC1（265例，75.7％）和MC2（85例，占24.3％）。Kaplan-Meier生存分析還表明，與MC2 GBM相比，MC1 GBM的患者的OS較差。

此外比較了TCGA隊列中患者的兩個MC之間GDRGs的表達模式和臨床病理特征。I型GDRG基因表達譜的表達水平顯著升高，II型GDRG基因表達譜的表達水平MC1 GBM的比MC2 GBM患者顯著降低。在CGGA驗證隊列中也觀察到了相同的發(fā)現(xiàn)。因此假設(shè)MC1患者主要對應(yīng)于I型GBM子集的功能特性，而MC2患者主要對應(yīng)于II型GBM子集的功能特性。

MC1型GBMs患者中I型GDRG metagene的表達水平顯著高于MC2型GBMs患者， II型GDRG metagene的表達水平顯著低于MC2型GBMs患者。在CGGA驗證隊列中也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。因此，因此假設(shè)MC1患者主要符合I型GBM亞群的功能特性，而MC2患者主要符合II型GBM亞群的功能特性。

表1.TCGA訓(xùn)練隊列和CGGA驗證隊列的MC1和MC2亞組GBM患者的基線資料

表1顯示了MC1和MC2 GBMs患者的人口學(xué)特征和臨床病理特征。與MC2患者相比，TCGA隊列和CGGA隊列中的MC1患者均明顯年輕(P=0.007)。然而，患者兩種MCs在其他變量上無顯著差異(P均> 0.05)。綜上所述，上述結(jié)果表明，基于GDRG的GBM患者分類在不同人群中是穩(wěn)健和可靠的，并且可以根據(jù)該分類明確區(qū)分不同的生存結(jié)局。

確定了6個主要免疫檢查點的表達，分別是PDCD1（PD1），CD274（PDL1），PDCD1LG2（PDL2），CTLA4，CD80和CD86，并比較了GBM患者的兩個GBM細胞亞群和兩個MC 。根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)，PD1，PDL1和PDL2在I型GBM細胞中高表達，而CTLA4，CD80和CD86在II型GBM細胞中高表達。就大量RNA序列數(shù)據(jù)而言，在TCGA數(shù)據(jù)庫和CGGA數(shù)據(jù)庫中，MC1 GBM患者中PD1，PDL1和PDL2高表達，而MC2 GBM患者中CTLA4，CD80和CD86高表達。

圖5.GBM患者的免疫治療反應(yīng)預(yù)測

之后使用腫瘤免疫功能障礙和排斥（TIDE）算法來預(yù)測免疫治療反應(yīng)的可能性。根據(jù)TCGA訓(xùn)練隊列的結(jié)果，MC2 GBM患者（43.7％，31/71）比MC1患者（20.0％，16/80，P = 0.003）更有可能對免疫療法產(chǎn)生反應(yīng)。同樣，在CGGA驗證隊列中，MC2 GBM患者比MC1患者更有可能對免疫療法作出反應(yīng)。

然后，進行SubMap分析以預(yù)測在GBM患者的兩個MC中對PD1和CTLA4抑制劑產(chǎn)生臨床反應(yīng)的可能性。TCGA和CGGA隊列中的MC1 GBM患者對抗PD1治療更敏感，而MC2 GBM患者對抗CTLA4治療的更敏感。

進行單變量Cox分析并在TCGA訓(xùn)練集中確定了45個與預(yù)后相關(guān)的GDRG。然后進行最小絕對收縮和選擇算子（LASSO），然后進行多變量Cox分析，并鑒定出4個顯著預(yù)測生存的GDRG：纖連蛋白1，載脂蛋白E，核糖體蛋白L7a和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶mu 2。FN1在GBM細胞和T細胞中顯著上調(diào)（一般）；在GBM細胞，CSC和巨噬細胞中，APOE明顯上調(diào)；RPL7A在GBM細胞，CSC和巨噬細胞中顯著上調(diào)；而GSTM2在GBM細胞和星形膠質(zhì)細胞中顯著上調(diào)。使用包括163個GBM（TCGA）樣品和207個正常（GTEx）樣品的基因表達譜交互式分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫驗證了這4個GDRG的表達。發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，GBM中所有4種可預(yù)測生存的GDRGs均上調(diào)。

圖6.預(yù)測模型中四個GDRG的表達和生存分析

Kaplan-Meier生存分析表明，GBM患者中FN1的高表達和APOE，GSTM2和RPL7A的低表達與GBM患者的OS差有關(guān)。

基于上述4個GDRG，使用以下公式開發(fā)了預(yù)后風(fēng)險評分模型：風(fēng)險評分= Exp FN1 ×1.66 + Exp APOE ×（-0.93）+ Exp RPL7A ×（-1.30）+ Exp GSTM2 ×（-0.90）。計算TCGA訓(xùn)練集中所有患者的風(fēng)險評分，并使用風(fēng)險評分的中位數(shù)作為臨界值，將患者分為高風(fēng)險（高評分）組或低風(fēng)險（低評分）組值。Kaplan-Meier生存分析表明，高危組患者的OS顯著低于低危組。用于OS預(yù)測的GDRG簽名的C指數(shù)為0.781。隨時間變化的接收器工作特性（ROC）分析還表明，GDRG簽名在預(yù)測0.5年，1年，2年和3年OS率方面表現(xiàn)出卓越的性能，曲線下面積（AUC）值為0.767， 0.712、0.752和0.776。

圖7. 基于GDRG的風(fēng)險評分模型的生存分析和風(fēng)險評分

然后使用CGGA隊列以類似方式驗證預(yù)測公式，所有GBM患者均分為高危組或低危組。與TCGA訓(xùn)練集的結(jié)果一致，生存分析也顯示高風(fēng)險組患者的OS顯著低于低風(fēng)險組患者。GDRG驗證的C指數(shù)為0.715，基于時間的ROC分析還提出了在CGGA驗證集中預(yù)測OS的有良好價值。這些結(jié)果表明，基于GDRG的預(yù)后風(fēng)險評分模型可以作為GBM患者不同人群的可靠預(yù)后指標(biāo)。

研究GDRG簽名的預(yù)后意義是否獨立于其他臨床病理變量來預(yù)測GBM患者的生存，進行了單變量和多變量Cox回歸分析，結(jié)果表明GDRG驗證在兩個患者中均獨立于OS。TCGA和CGGA隊列（表2）。

表2.TCGA GBM培訓(xùn)隊列和CGGA GBM驗證隊列中臨床病理變量和GDRG驗證的單變量和多變量Cox比例風(fēng)險分析

最后成功開發(fā)了預(yù)后列線圖，為個體OS預(yù)測提供了臨床上可應(yīng)用的定量方法。年齡，藥物治療，放療，IDH突變狀態(tài)，MGMT啟動子甲基化狀態(tài)和GDRG特征包含在最終的OS預(yù)測模型中，預(yù)后列線圖的C指數(shù)為0.896?；跁r間的ROC分析顯示，對于0.5年，1、2年和3年OS率具有良好的預(yù)測能力，AUC值分別為0.734、0.771、0.864和0.919。校正圖顯示了預(yù)測的0.5年，1年和3年OS率與TCGA隊列中的實際觀察值之間的極好的一致性。然后在CGGA隊列中驗證了預(yù)后模型，其C指數(shù)為0.729。0.5年，1年，2年和3年OS率隨時間變化的AUC與預(yù)后諾模圖分別為0.725、0.696、0.694和0.701。以上發(fā)現(xiàn)表明，預(yù)后諾模圖方法可用于OS預(yù)測，在不同人群的GBM患者中具有較高的可靠性。

圖8. 預(yù)后列線圖可預(yù)測GBM患者的0.5年，1年和3年OS

文章中作者首先使用單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)通過軌跡分析確定了處于不同分化狀態(tài)的兩個GBM細胞亞群，探索了GBM細胞分化相關(guān)基因（GDRGs）的生物學(xué)功能，隨后使用4個可預(yù)測OS的關(guān)鍵可預(yù)測GDRG（FN1，APOE，RPL7A和GSTM2）和其他臨床病理變量為GBM患者構(gòu)建了分子分型以及預(yù)后預(yù)測模型進行驗證。最后確定了不同的腫瘤內(nèi)GBM細胞分化狀態(tài)，根據(jù)GBM細胞的分化特征對患者進行分類可以預(yù)測腫瘤的免疫治療反應(yīng)和患者生存率，對免疫治療反應(yīng)具有重要作用。