電轉(zhuǎn)化流程實(shí)驗(yàn)原理胞電轉(zhuǎn)染（電轉(zhuǎn)），也叫細(xì)胞電穿孔 (electroporation)，是把外源大分子物質(zhì)DNA、RNA、siRNA、蛋白質(zhì)等以及一些小分子導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)部的重要方法。 在瞬間強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，溶液中細(xì)胞的細(xì)胞膜具有了一定的通透性，帶電的外源物質(zhì)以類似電泳的方式進(jìn)入細(xì)胞膜。由于細(xì)胞膜磷脂雙分子層的電阻很大，細(xì)胞外部電流場(chǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞兩極電壓都被細(xì)胞膜承受，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分到的電壓可以忽略不計(jì)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部幾乎沒有電流，因此也決定了正常范圍內(nèi)的電轉(zhuǎn)過程中細(xì)胞毒性很小。電場(chǎng)使DNA等物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞膜后只能停止在細(xì)胞膜附近，隨后細(xì)胞本身的機(jī)制可以允許這些物質(zhì)到細(xì)胞核等處。 普通電轉(zhuǎn)能量過高可導(dǎo)致部分細(xì)胞因膜破壞而死亡，其中能存活下來的細(xì)胞內(nèi)部都不會(huì)受到電流影響，因?yàn)榧?xì)胞膜完整是細(xì)胞存活的必要條件。 由于電轉(zhuǎn)技術(shù)依靠的是物理方法，細(xì)胞表面的分子特性對(duì)電轉(zhuǎn)影響比較小。相比化學(xué)轉(zhuǎn)染方法和病毒載體轉(zhuǎn)染方法，電轉(zhuǎn)可以用在所有的細(xì)胞種類上，而且容易定量控制。 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)步驟1.用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10ml LB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中。（同時(shí)做培養(yǎng)基和槍頭的空白對(duì)照） 2.37℃，220rpm，培養(yǎng)14-16個(gè)小時(shí)。 3.第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000ml LB液體培養(yǎng)基中，37度，220rpm，振搖2-3小時(shí)，每半小時(shí)測(cè)一次OD，當(dāng)OD值達(dá)到0.3-0.4時(shí)，停止培養(yǎng)。 4.將菌液在冰上預(yù)冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500ml 預(yù)冷的離心杯中，4℃，2500rpm離心10分鐘。 5.棄上清，離心杯中加入少量ddH2O，使沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯，4℃，4000rpm離心10分鐘。 6.棄上清，加少量滅菌水，重懸菌體，再將水注滿離心杯，4000rpm，4℃，離心10min。 7.棄上清，往離心杯中加入少量10%甘油(滅菌，預(yù)冷)，重懸菌體，再加滿10%甘油, 4℃, 4000rpm, 離心10min。 8.棄上清，每個(gè)離心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀懸浮后，將菌液以300ul/管分裝于1.5ml的離心管中，-80 ℃冰箱中保存。同時(shí)取100 μl感受態(tài)加0.01ng puc18直接電穿孔轉(zhuǎn)化，檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率。 9. 次日觀察轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況，并記錄。 二、連接產(chǎn)物純化 1．將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列試劑: 10μl of ddH2O 2μl of 3M NaAC（PH5.2） 50μl of 無水乙醇 輕輕混勻，稍微離心并將其置于-20℃放置1小時(shí)以上； 2.4℃，top Speed 離心30分鐘； 3.小心移去上清，避免接觸到管底的沉淀物； 4.加入500μl70%的乙醇，輕輕顛倒幾次洗滌沉淀（注：不要離心混勻）； 5.4℃，top Speed離心5分鐘； 6.小心移去上清，將此Eppendorf管置空氣中直至無乙醇?xì)馕叮?/p> 7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆茫?/p> 三、電轉(zhuǎn)化 1.從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍； 2.取1 μl 純化后的質(zhì)粒于一1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預(yù)冷。 3.將40～100ul解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml 的離心管中，小心混勻，冰上放置10min。 4.打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.1KV。 5.將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極杯的底部； 6.將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入1000μl的SOC液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。 7．37℃，220－250rpm復(fù)蘇1小時(shí)。 8. 取20μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加160μlSOC涂板，放于37℃溫室，過夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。其余菌液加1：1的30%的甘油后混勻－80℃保存。 四、電擊杯清洗流程 1.用清水將電擊杯稍沖一下。 2.向電擊杯中加入的75%酒精浸泡2hr。 3.棄去酒精，再用蒸餾水沖洗2~3遍，然后用1ml的槍吸取超純水反復(fù)吹打電擊杯10遍以上。 4.加入無水乙醇2ml于電擊杯中，浸泡30分鐘。 5.棄去無水乙醇，于通風(fēng)廚內(nèi)揮干乙醇。 6.將清洗好的電擊杯放入-20 ℃冰箱內(nèi)待用。 注意事項(xiàng)1. 每塊加有Amp的平板上均勻涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。 2. 不同樣品使用的電機(jī)杯應(yīng)分開。 3.每周用1%酒精浸泡30分鐘。 其他1. 選擇合適的電場(chǎng)強(qiáng)度合適的電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)于電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)非常重要，電場(chǎng)強(qiáng)度不能過高，過高會(huì)增加細(xì)胞的死亡率；也不能過低，過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細(xì)胞系具有不同的最佳場(chǎng)強(qiáng)值，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)測(cè)定所轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的最佳電場(chǎng)強(qiáng)度。 2. 細(xì)胞的選擇用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（15代以內(nèi)，傳代后2d）。因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分裂旺盛，表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細(xì)胞差，電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng)，而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA. 3. 質(zhì)粒的質(zhì)量應(yīng)選擇純度高的質(zhì)粒，首先DNA／RNA應(yīng)該超純（A260／A280>1.8），其次應(yīng)不含內(nèi)毒 素，同時(shí)質(zhì)粒應(yīng)溶于雙蒸水而不是TE緩沖溶液。另外，DNA濃度不宜過高。 4. 選擇合適的電轉(zhuǎn)染試劑電擊會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定程度的傷害，在轉(zhuǎn)染試劑的選擇上要注意，應(yīng)選擇具有細(xì)胞膜修復(fù)成分的電轉(zhuǎn)染試劑，如Entranster-E，可將電擊對(duì)細(xì)胞的損傷降到最低。并且，Entranster-E可適用于lonza、Bio-rad、BTX等多種電轉(zhuǎn)儀。 |
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