【原】心衰伴心室輔助裝置患兒循環(huán)miRNA變化的初步研究

非編碼研究園地 2021-02-01

展開全文

論文：Variations of circulating miRNA in paediatric patients with Heart Failure supported with Ventricular Assist Device: a pilot study（心衰伴心室輔助裝置患兒循環(huán)miRNA變化的初步研究）

摘要

循環(huán)miRNAs(c-miRNAs)是HF診斷和預后的有希望的生物標志物.目前還沒有關于心衰患兒接受VAD植入術的研究。本研究的目的是：檢查高頻兒童的c-miRNAs譜；評價vad對c-miRNAs水平的影響；離體驗證推測的c-miRNA靶點。

應用神經生長抑素(NGS)法測定心衰患兒VAD植入前后血清C-miRNA譜.在VAD植入前、4小時、1、3、7、14、30天，用實時PCR方法檢測c-miRNA的差異表達.通過miRNA模擬轉染HepG 2細胞的研究，驗證了miRWalk數(shù)據(jù)庫篩選的miRNA靶點。

在VAD植入后30天，對13個c-miRNAs進行修飾，與NSG的VAD前比較，其中6個c-miRNAs經Real-TimePCR證實。被證實的c-miRNAs的靶基因參與了止血過程.這個離體研究證實hsa-miR-409-3p對凝血因子7(F7)和F2有下調作用。

值得注意的是，所有患者都有需要泵改變的血栓事件?？傊?，在HF兒童中，VAD治療30天后，參與調節(jié)止血事件的6種c-miRNAs的水平發(fā)生了變化。特別是c-miR-409-3p調節(jié)F7和F2的降低，可反映VAD植入后的血栓形成狀態(tài)。

結果

實驗設計在臨床環(huán)境中，在VAD植入后1個月之前和期間，從HF兒童(n=5，研究樣本)中采集血清樣本(1)。為鑒定VAD治療修飾的c-miRNA，從VAD治療前和治療后1個月的血清標本中分離出c-miRNA，用下一代測序(NGS)(2，發(fā)現(xiàn)階段)進行c-miRNA譜分析，經精細統(tǒng)計分析后，用實時PCR(3，驗證階段)對測序結果進行驗證。

結果經臨床推廣，在VAD植入后1個月內不同時間點采集的血清標本進行實時PCR檢測(4)，并與VAD植入后1個月內發(fā)生的不良事件相關(5)。

最后，為了預測選定的c-miRNAs的靶區(qū)，硅中使用基因本體和miRWalk軟件進行分析(6)，并對已識別和臨床選擇的目標進行了驗證。離體特異性miRNA-模擬物轉染HepG 2細胞的研究(7)。

C-miRNAs譜

應用NGS技術獲取一組小兒HF患者血清miRNAs譜(N=5，補充表)。VAD植入后1個月?？偟膩碚f，平均每個樣本中有340個c-miRNAs，所有樣本中都有169個。C-miRNAs圖譜的層次聚類分析。

顯示，在全球范圍內，他們并沒有在VAD前后的樣本中分組.然而，與VAD后相比，VAD前血清中共有13例c-miRNAs有差異(adj-p<0.1).其中9例c-miRNAs表達下調，4例c-miRNAs表達上調。差異表達的c-miRNAs的詳細列表載于補充表。

測序數(shù)據(jù)的實時PCR驗證

為了驗證測序結果，我們還用實時PCR對13種c-miRNAs進行了定量分析.其中6個c-miRNAs的差異表達譜與NGS實驗結果一致.具體來說，hsa-miR-483-3p，hsa-miR-409-3p和hsa-miR-485-3p在VAD治療1個月后下降到無法檢測到的水平。

植入VAD后，HSA-miR-432-5p呈下降趨勢，hsa-miR-150-3p和hsa-miR-375呈上升趨勢(圖1)。選擇這6種miRNAs進行下游分析。

C-miRNA識別靶區(qū)的實驗驗證

由于F_2、F_5、F_7、F_8、F_9和proc在肝臟中均有表達，因此，采用miRNA模擬轉染技術，以HepG 2細胞為研究對象，對所選c-miRNA的靶點進行了鑒定。

轉染hsa-miR-409-3p模擬物后48h細胞中F7的表達水平明顯低于單純轉染miRNA(miR-CT)模擬或脂質體的細胞(見圖)。此外，轉染hsa-miR-409-3p后，F(xiàn)2的表達水平與單純脂質體處理的對照組相比明顯降低(見圖)。這些結果證實hsa-miR-409-3p在HepG 2中對f7和f2的調節(jié)作用。