本文介紹QPCR的結(jié)果如何統(tǒng)計(jì)分析。

我們將以案例的方式，針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)介紹如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，今天主要介紹案例1。

案例1

假設(shè)我們有一個(gè)藥物，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中看他對(duì)于p53 mRNA水平的影響，那么如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組呢？如何分析結(jié)果？

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別種兩小皿（3.5cm）細(xì)胞，一皿加藥，另外一皿加對(duì)照。處理一段時(shí)間之后，分別收細(xì)胞提RNA，逆轉(zhuǎn)錄，然后準(zhǔn)備做qPCR，這個(gè)時(shí)候我們需要做的qPCR孔如下：

注意這里面要區(qū)別一個(gè)概念是“獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)”和“PCR重復(fù)”，上面p53和GAPDH都有三個(gè)PCR孔，這是PCR重復(fù)，為了消除本次操作誤差。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)指的是我們做的三次獨(dú)立的重復(fù)試驗(yàn)，具體到本例中，就要求我們?cè)谄渌麜r(shí)間做再種兩小皿細(xì)胞，再提mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄，再做qPCR，如此做了三次實(shí)驗(yàn)后才能算作獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)，我們統(tǒng)計(jì)的時(shí)候統(tǒng)計(jì)的是獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)，而不能單純以上面三個(gè)孔作為統(tǒng)計(jì)誤差的來(lái)源。

做完上述實(shí)驗(yàn)之后，我們得到如下的結(jié)果（下圖中值均為Ct值）：

第一次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)Test1

我們?cè)僮鰞纱为?dú)立重復(fù)試驗(yàn)，得到結(jié)果如下：

第二次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)Test2

第三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)Test3

結(jié)果分析

下圖為計(jì)算過(guò)程，是qPCR計(jì)算的核心所在，大部分同學(xué)都在此處不知如何計(jì)算

△Ct=Ct(p53)-Ct(GAPDH);

這里需要注意的是2^-△△Ct的計(jì)算，首先我們把對(duì)照里面的2^-△Ct求平均（上圖中為0.000780573），然后用2^-△Ct 中的每一個(gè)數(shù)據(jù)除以這個(gè)數(shù)據(jù)，對(duì)照組也同樣除。

接著我們?cè)僬硐聰?shù)據(jù)：

那么這個(gè)就可以畫(huà)出柱形圖了~

雖然偏差都有了，雖然看上去相差那么大，如何確定P值呢。我們可以采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)統(tǒng)計(jì)P值，在此就不再說(shuō)明，需要強(qiáng)調(diào)的是我們要確定用什么檢驗(yàn)方法來(lái)檢驗(yàn)顯著性差異，因?yàn)槲覀兪嵌际仟?dú)立的樣本，所以我們采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法來(lái)檢驗(yàn)。SPSS的使用方法在這就不介紹了。（可以登錄科研狗網(wǎng)站http://www.）。

最后強(qiáng)調(diào)下，這種方法只適用于單因素處理比較，這個(gè)因素（本例子中為加藥）處理得到的結(jié)果應(yīng)該是穩(wěn)定的（表示在相同細(xì)胞中加相同濃度的藥物，p53mRNA的變化水平也是一致的）。

在臨床上我們經(jīng)常會(huì)做到比較癌和癌旁中某種基因mRNA水平的差異，這種不能用上面方法，因?yàn)閭€(gè)體差異非常大，每個(gè)人的癌和癌旁都不一樣，不能把每個(gè)人的癌和癌旁當(dāng)作是獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的重復(fù)（Test1,Test2,Test3...），今天的分享就到這里，下一篇文章給大家補(bǔ)充。